（ Genetic Information Transfer ） 第 三 篇 基因信息的传递 （ Genetic Information Transfer ） 主讲：李志红

会道的一缕藕丝牵大象 盲修者千斤铁棒打苍蝇 ——云南昆明圆通寺楹联

reverse transcription * 中心法则(the central dogma) 转录 翻译 复制 DNA RNA protein 逆转录 replication transcription translation reverse transcription

主要内容 ● RNA的生物合成 —— 转录 ● 蛋白质的生物合成 —— 翻译 ● 基因表达调控 ● 基因重组与基因工程 ● DNA的生物合成 —— 复制 ● RNA的生物合成 —— 转录 ● 蛋白质的生物合成 —— 翻译 ● 基因表达调控 ● 基因重组与基因工程

第十章 DNA 复制 （DNA Replication, or DNA Biosynthesis）

DNA的生物合成 复制(replication)： 以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。 复制 逆转录 复制 子代DNA 亲代DNA

本章主要内容： • 复制的基本规律 • DNA复制的酶学和拓扑学变化 • 复制的过程 • 逆转录和其他复制方式 • DNA损伤(突变)与修复

Basic Rules of DNA Replication 第一节 复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication

DNA 的双螺旋结构 Watson and Crick， 1953 人类科学发展历史上的伟大里程碑。

Watson and Crick with DNA model ，1993 In 1962 Watson, Crick and Wilkins received the Nobel Prize in Physiology or Medicine. Watson and Crick with DNA model ，1993

Double helix structure of DNA “It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.” Watson & Crick

全保留式 半保留式 混合式 一、DNA复制的方式 DNA复制的三种可能方式 全保留式 　半保留式 混合式 (Conservative model) (semiconservative model) (dispersive model)

Meselson and Stahl (1958)

Photograph of Matt Meselson and Frank Stahl in 1996, standing at the site where they met at Woods Hole 42 years earlier.

（semiconservative replication） 半保留复制 （semiconservative replication） DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。

半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。在强调遗传恒定性的同时不能忽视其变异性。

二、DNA复制的方向 ——单向？双向？

Examination of T7 DNA replication using electron microscopy Origin of replication

双向复制 (bidirectional replication) 原核生物： • 基因组是环状DNA • 只有一个复制起始点 复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，称为双向复制。

复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉(replication fork) 。

Replication of prokaryotes（原核生物） 在原核生物双向复制中，DNA被描述为眼睛状或形 ( replication)

• 染色体DNA有多个复制起始点。 真核生物(DNA Replication in eukaryotes)： • 两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。

Replication of eukaryotes（真核生物）

三、链延伸的方向 ——5’→3’？3’→5’？Or both?

his wife Tsuneko Okazaki Reiji Okazaki and his wife Tsuneko Okazaki 冈崎片段(Okazaki fragments)： • 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 • 原核生物: 1000-2000个核苷酸 • 真核生物: 100-200个核苷酸 领头链 随从链 解链方向

复制的半不连续性 (semidiscontinuous replication) 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为领头链(leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(lagging strand) 。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性(semidiscontinuous replication) 。

小结：DNA复制的基本规律 半保留复制 (semi-conservative replication) 双向复制 (bidirectional replication) 半不连续复制 (semi-discontinuous replication)

The Enzymology of DNA Replication 第二节 DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication Large team of enzymes coordinates replication Let’s meet the team…

DNA复制的体系 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol) 模板: 解开成单链的DNA母链 引物: 提供3'-OH末端的寡核苷酸 底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol) 模板: 解开成单链的DNA母链 引物: 提供3'-OH末端的寡核苷酸 其他酶和蛋白质因子: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶

一、复制的化学反应 3 5 3 5 53 polymerizing

We come with our own energy! Where’s the ENERGY for the bonding! (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi

聚合反应的特点 DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 → 3方向进行 。

二、DNA聚合酶 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol 1959 年获诺贝尔生理学或医学奖 奥乔亚 科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg

Kornberg liked to refer to his scientific career as a "love affair with enzymes." Arthur Kornberg (left) with his son, Roger, after Roger received the 2006 Nobel Prize in Chemistry.

DNA聚合酶 活性： 1. 53 的聚合活性 (The polymerase activity) 2. The 3` to 5` exonuclease activity 3. The 5` to 3` exonuclease activity Why does a DNA polymerase also need two exonuclease activities?

? 核酸外切酶活性(exonuclease activity) 3  5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。校对作用 5´ A G C T T C A G G A T A  3´ | | | | | | | | | | | 3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´ ? 3  5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。校对作用 5  3外切酶活性 能切除引物和突变的 DNA片段。

（一）原核生物的DNA聚合酶 Oh！ How fast! 功能 校读、修复合成、切除引物填补空隙 参与DNA损伤的应急状态修复

DNA-polⅠ DNA聚合酶活性   5 核酸外切酶活性 C 端 木瓜蛋白酶 小片段 大片段（Klenow 片段） （323个氨基酸） （604个氨基酸） 5  核酸外切酶活性 DNA聚合酶活性   5 核酸外切酶活性 Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA聚合酶II (DNA-pol II) • 具有5′→3′的聚合酶活性。 • 只是在无polⅠ及polⅢ的情况下暂时 起作用。 • 对模板的特异性不高, 参与DNA损伤 的应急状态修复。

DNA聚合酶III (DNA-pol III) 是复制延长中真正起催化作用的酶。 由10种亚基组成不对称的聚合体。 α，ε，θ亚基组成核心酶，α亚基具有5‘→3’的聚合活性，ε亚基具有3‘→5’外切酶活性， θ亚基可能起组装作用。 β亚基(DNA夹子)：能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。 其余亚基统称为γ-复合物, 是DNA夹子加载蛋白。

DNA Polymerase III- does the bulk of copying DNA in Replication β2 subunit: sliding clamp

（二）真核生物的DNA聚合酶 DNA-pol  起始引发，有引物酶活性。 DNA-pol  参与低保真度的复制。应急修复。 复制的主要酶，有解螺旋酶活性。 DNA-pol  在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。

三、DNA复制的保真性 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能。

1×10-5　 1×10-2 1×10-9

四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白 原核生物复制起始的相关蛋白质 理顺 DNA 链 拓扑异构酶 ( gyrA , B) 稳定已解开的单链 SSB 催化 RNA 引物生成 引物酶 DnaG dnaG ) 运送和协同 DnaB DnaC dnaC 解开 双链 解螺旋酶 dnaB 辨认起始点 DnaA dnaA 蛋白质（基因） 通用名 功能 原核生物复制起始的相关蛋白质

解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 Dna B Dna C 解链方向

单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。

引物酶(primase) 引物（primer）： 依赖DNA的RNA聚合酶。 对利福平不敏感。 可以催化游离NTP聚合。 在大肠杆菌，是dna G 基因的表达产物。 催化RNA引物的生成 。 引物（primer）： 　 是由引物酶催化生成的短链RNA（长度为十几~几十个核苷酸），它可为DNA聚合提供3'-OH末端。

DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase, or DNA gyrase)

拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 克服解链过程中的打结、缠绕现象 分 类 拓扑异构酶Ⅰ 拓扑异构酶Ⅱ

拓扑异构酶Ⅰ的作用 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。

拓扑异构酶Ⅱ的作用 切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）

DNA连接酶（DNA Ligase） 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。 HO 5’ 3’ DNA连接酶 ATP（NAD+） AMP

DNA连接酶的功能 在复制中起接合双链中单链缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 是基因工程的重要工具酶之一。

小结：DNA复制酶系总揽

The Process of DNA Replication 第三节 DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication

一、原核生物的DNA生物合成 （一）复制的起始 需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。 2. 合成引物，提供3-OH末端；形成引发体。

1. DNA解链 DNA sequences at the Bacterial origin of Replication

Initiation of Replication at oriC DNA replication is initiated by the binding of DnaA proteins to the DnaA box sequences

2. 引发体和引物 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 Dna B、 Dna C Dna A 5 SSB 3 5 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。 3 引物酶 3' HO 5' 引物 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

（二）复制的延长 复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

复制过程简图 RNA引物

复制叉的结构

Structure of the Moving Complex flash Structure of the Moving Complex

（三）复制的终止 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 E.coli ori 82 32 ter

随从链上不连续性片段的连接 5 RNA酶 5 DNA-pol Ⅰ dNTP 5 ATP DNA连接酶 AMP+PPi 5 OH P

二、真核生物的DNA生物合成 哺乳动物的细胞周期 DNA合成期

（一）复制的起始 • 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。 • 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)，增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)。

（二）复制的延长 3 5 领头链 亲代DNA 随从链 引物 核小体

（三）复制的终止和端粒酶 DNA复制与核小体装配同步进行。 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制终止包括： 冈崎片段、复制子之间的连接。 端粒的合成

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 伊丽莎白-布莱克本(Elizabeth Blackburn) 卡罗尔-格雷德(Carol Greider) 杰克-绍斯塔克(Jack Szostak) "for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase"

TELOMERES What are they? Why are they important? Telomere shortening and the end-replication problem Telomerase Telomere hypothesis of aging

真核生物端粒的形成： 端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。

Big problem: 真核生物复制的终止 ——"末端复制问题" 染色体DNA呈线性，复制在末端停止。

端粒酶(telomerase) 端粒酶的分子结构 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。 端粒酶的分子结构

端粒酶的爬行模型 (inchworm model)

端粒酶的爬行模型 （动画演示）

DNA聚合酶复制子链 进一步加工

端粒及端粒酶的意义 成年人端粒比胚胎细胞端粒短； 老化与端粒酶活性下降有关； 肿瘤的发生与端粒酶活性有关； 端粒酶不一定能决定端粒的长度。 端粒：“生命时钟” 好好看住端粒，别丢了哦！

Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 第四节 逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways

一、逆转录病毒和逆转录酶 RNA DNA 逆转录 (reverse transcription)

逆转录酶 (reverse transcriptase) 从RNA病毒中发现，能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，全称为依赖RNA的DNA聚合酶。 有三种活性：RNA指导的DNA聚合活性 RNase H活性 　　　　　　 DNA指导的DNA聚合活性

逆转录病毒细胞内的逆转录现象 RNA 模板 逆转录酶 DNA-RNA 杂化双链 RNA酶 单链DNA 双链DNA

试管内合成cDNA cDNA complementary DNA 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 逆转录酶 A AA A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 cDNA complementary DNA 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

1975 Nobel Prize in Physiology or Medicine David Baltimore Howard M. Temin In 1970 Discover RNA-dependant DNA polymerase which later known as reverse transcriptase. 1975 Nobel Prize in Physiology or Medicine

DNA Damage (Mutation) and Repair 第五节 DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair

从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 突变 (mutation)： 从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 DNA损伤 (DNA damage)： 泛指一切DNA结构和功能的变化。包括各种突变类型、碱基的损伤和DNA链的断裂。 双螺旋结构的异常扭曲-----对DNA复制或转录可产生生理性伤害。

一、突变的意义 （一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素 自发性: 自然错配率约为10-9～10-10 左右。 物理因素: 如UV (ultra violet)、各种辐射。 自发性: 自然错配率约为10-9～10-10 左右。 物理因素: 如UV (ultra violet)、各种辐射。 化学因素: 烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发突变的化学物质,称为致癌剂。 生物因素: 抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。

物理因素

化学因素 常见的化学诱变剂 化合物类别 作 用 点 分子改变 碱基类似物 - A - ® - G - A 5 - BU ® G 如： 5 - T - - C - - T - NH OH - C - 羟胺类（ ） T ® C 2 - A - - G - - G - - A - 亚硝酸盐（ NO ） C ® U 2 - C - - T - 烷化剂 m m G G ® ® G G DNA 缺失 G 如：氮芥类， Nitromins

Nitrous acid(HNO2): react with base that contain amino groups, deaminates C to produce U, resulting in G·C  A·U

三、突变的分子改变类型 错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement) 框移 (frame-shift)

（一）错配 DNA分子上的碱基错配称点突变 (point mutation) 1. 转换 发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换

正常成人Hb (HbA)β亚基 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · · · C 肽链 CTC GAG 基因 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · · · C 肽链 CAC GTG 基因

（二） 移码突变（Frame-shift mutation） ■ DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个（但不包括三个或其倍数）碱基，导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。 谷 酪 蛋 丝 丙 缬 组 缬 正常 5’ ……G A G U A C A U G U C …… 缺失C 5’ ……G C A G U A C A U G U C ……

（三）重排 DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

四、DNA损伤的修复 修复(repairing) 修复的主要类型 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。 光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复

（一）光修复 光修复酶 300~600nm

（二）切除修复 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 E.coli的切除修复机制 UvrC UvrA UvrB UvrC OH P DNA聚合酶Ⅰ DNA连接酶 NAD+ （二）切除修复 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 E.coli的切除修复机制

着色性干皮病(xeroderma pigmentosis，XP) 是一种发生在暴露部位的色素变化，萎缩，角化及癌变的遗传性疾病，属常染色体隐性遗传病。 切除修复缺陷性的遗传病。 XP病人细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低，不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，因此易发生皮肤癌。 XP病人首先表现为对日光的高度敏感，该症状在出生后到一岁就可能出现，患者经轻度日晒后就会皮肤发红，出现雀斑、水疱，皮肤萎缩、变薄、毛细血管扩张、色素沉着等。 肿瘤一般在10岁内出现，大多数患者在20岁前就发展为肿瘤期。另外，约有40％的患者可同时伴有眼睛的损害，约20％的患者有神经症状。

欧洲航天局用太空技术造福“着色性干皮病”患儿 所以，对于着色性干皮病患者来说，严格避光是非常重要的，而且要终身避光，外出时要涂抹防晒霜。如发现皮肤的癌性病变，要进行早期切除。 欧洲航天局用太空技术造福“着色性干皮病”患儿 英国和法国的两位着色性干皮病患儿穿了欧洲航天局为他们定做的连体防护服，这种防护服可使他们在户外不被紫外线灼伤。 连体服使用了太空飞船表面使用的防辐射涂料，以保证紫外线不能穿透连体服。为了让患儿在夏天穿着防护服时不会感到闷热，防护服内还专门嵌入了一种太空冷却系统。

（三）重组修复

（四）SOS修复 当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。 在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。

本章要点 复制的基本规律（概念） 参与DNA复制的分子（底物、模版、引物），酶和蛋白质（功能） DNA的合成过程 逆转录:cDNA 半保留复制，双向复制（复制叉），半不连续复制（领头链、随从链、冈崎片断） 参与DNA复制的分子（底物、模版、引物），酶和蛋白质（功能） DNA 聚合酶，解螺旋酶，引物酶，SSB，拓扑异构酶，连接酶 DNA的合成过程 原核生物（重点）：起始、延长、终止 真核生物：端粒与端粒酶 逆转录:cDNA DNA损伤与修复 紫外线损伤，点突变，框移突变 光复活、切除修复

思考题 1.DNA复制起始有哪些特点? 2.原核生物与真核生物中的DNA聚合酶有哪些种 类，它们各有什么功能? 6.什么是逆转录？有何生物学意义? 7.生物体内的DNA损伤有哪些方式和类型?如何修复? 