第二章 DNA的结构 第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 DNA的物理化学性质 第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 DNA的物理化学性质 第五节 超螺旋和拓扑异构

第一节 遗传物质的本质

一、DNA携带两类不同的遗传信息 1、 遗传物质必须具有的特性 DNA的特征 a、贮存并表达遗传信息 各异的碱基序列储存大量的遗传信息 1kb DNA序列 41000 种遗传信息 b、能把信息传递给子代 DNA的复制是其表达和传递遗传信息的基础 c、物理和化学性质稳定 生理状态下物理、化学性质 稳定 d、具有遗传变化的能力 有突变和修复能力，可稳定遗 传是生物进化的基础

2、 DNA携带两种遗传信息 a、编码蛋白质和RNA的信息(编码tRNA、 rRNA) 编码氨基酸的61个密码子有简并性、通用性 64个三联体密码子 3个终止密码子 编码氨基酸的61个密码子有简并性、通用性

b、编码基因选择性表达的信息 基因选择性表达表现在： 细胞周期的不同时相中 个体发育不同阶段 不同的器官和组织 不同的外界环境下基因的表达与否以及量的差异

* 真核生物的结构基因占Genome的比例很小 Φx174phage 5386bp 结构基因用去5169bp 比例达96％ * 真核生物的结构基因占Genome的比例很小 哺乳动物中结构基因只占10％～15％

其余80％以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息 所以又称－－调控序列

二、 RNA也可作为遗传物质 * RNA病毒 传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳） 如: 烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus ，TMV) * 类病毒（viroid）: 使高等植物产生疾病的传染性因子 只由RNA组成, 无蛋白质外壳保护, 游离的共价闭合环状单链RNA分子

Prion (proteinaccous infections particle) 朊病毒－－－蛋白质样的感染因子 三、 是否存在核酸以外的遗传物质 Prion (proteinaccous infections particle) 朊病毒－－－蛋白质样的感染因子 羊搔痒病 (scripie) 人类库鲁（ kuru） 病 牛海绵状脑炎(疯牛病)… 均由传染性病原蛋白颗粒引起 统称Prion (朊病毒) Prion 复制? 转录? 翻译?

人类朊病毒疾病、症状及发病机理 疾病 症状 发病机理 发现病例 约2600例 约80例 约100个家族 46例 约50个家族 9个家族 库鲁病（Kuru） 共济失调、继发痴呆 通过同类相食（人）传染 约2600例 医源性克雅氏病(iCJD） 痴呆，共济失调 通过朊病毒污染的HGH，或通过角膜移植 约80例 家族性克雅氏病 同上 PrP基因种系突变 约100个家族 零星发生克雅氏病 体细胞突变PrPc自发转变为PrPsc？ 每年发生率约百万分之一 克雅氏病新突变体vCJD 共济失调，常伴有痴呆 牛朊病毒传染？ 46例 GS综合症（GSS） 约50个家族 致死性家族失眠症（FFI） 睡眠隔离，接着失眠，痴呆 PrP基因种系突变（D178N和M129） 9个家族

致死性中枢神经系统的慢性退化 病理表现：大脑皮层的神经原细胞退化、空泡变性、死亡、消失，最终被星状细胞取代，因而造成海棉状态

朊病毒带来了诺贝尔生理/医学奖 1997 Stanley B.Prusiner 发现朊病毒是作为老年性痴呆症等疾病的病原并能在寄主细胞中繁殖传播

第二节 核酸的化学组成

嘧啶 Pyrimidines 嘌呤 Purines 一、 碱基、核苷、核苷酸 ☉ 碱基 Nitrogenous bases Uracil (U) 嘧啶 Pyrimidines 嘌呤 Purines

☉ 核苷（nucleotide） 嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子 糖苷键 Glycosidic bond 核糖是戊糖 RNA－核糖核苷 DNA－脱氧核糖核苷

☉ 核苷酸（nucleotide acid） 核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸 9 1’ γ β α dNTP 其中α和β、β和γ之间是高能磷酸键

核糖核苷三磷酸缩写为NTP 碱基＋戊糖＝核苷 核苷＋磷酸＝核苷酸

2、 链的方向：同一个磷酸 基的3’酯键到5’酯键的方向 (5’→3’) 二、DNA分子的一级结构 (DNA sequence) 1、 多聚核苷酸链 主链是核糖和磷酸 侧链为碱基 3’ 5’ 由3’,5’磷酸二酯键连接 2、 链的方向：同一个磷酸 基的3’酯键到5’酯键的方向 (5’→3’) 5’-UCAGGCUA-3’ = UCAGGCUA 默认书写顺序5‘→3’

第二节 DNA的二级结构

一、 DNA双螺旋模型的提出（double helix model） * 1953. Watson & Crick 右手 B- DNA Double helix Model

* 双螺旋的主链 每一单链具有 5‘ 3’极性 两条单链极性 相反,反向平行 两条单链间以氢 键连接 以中心为轴，向 右 盘 旋 （直径2nm） 双 螺 旋 中 存 在 大，小 沟

磷酸二酯链 (Phosphodiester Backbone)

碱基互补 C-G T-A

* 双螺旋模型参数 · 两个碱基之间的垂直 · 直径20Å · 螺距为34Å（任一条链 绕轴一周所升降的距离） · 每圈有10个核苷酸 * 双螺旋模型参数 · 直径20Å · 螺距为34Å（任一条链 绕轴一周所升降的距离） · 每圈有10个核苷酸 （碱基） · 两个碱基之间的垂直 距离是3.4Å。螺旋转 角是36度 · 有大沟和小沟 配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称

二、 影响双螺旋结构稳定性的因素 * 维持稳定性的因素 弱键, 可加热解链 氢键堆积, 有序排列(线性, 方向) 强键, 需酶促解链 二、 影响双螺旋结构稳定性的因素 * 维持稳定性的因素 l       氢键 (Hydrogen bond 4~6 kc / mol) 弱键, 可加热解链 氢键堆积, 有序排列(线性, 方向)  l       磷酸酯键 (phosphoester bond 80~90 kc / mol) 强键, 需酶促解链 l  0.2 mol / L Na+ 生理盐条件 消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力

l   碱基堆积力 (非特异性结合力) ☆ 范德华力（Van de waals force） (1.7A°/ 嘌呤环与嘧啶环 作用半径) 3.4A° (0.34 nm/碱基对间距) ( 1 kc / mol —0.6kc / mol ) ×n

☆ 疏水作用力 (Hydrophobic interaction) (磷酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列 ) 不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力. * 不稳定因素 l  磷酸基团间的静电斥力    碱基内能增加(温度), 使氢键因碱基排列有序状态的破坏 而减弱

三、双螺旋结构的基本形式 · B-DNA 资料来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维 · 此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋 Z构象等形式 DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同 一种双螺旋结构内参数存在差异的现象 原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键 磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键

A B Z Base Inclination Handedness

A B Z 大沟不存在 小沟窄 小沟宽浅 大沟宽 小沟窄而深 大沟变深 小沟窄

四、一些DNA序列的不寻常结构 1、反向重复序列与二级结构 or inverted repeats IR） 反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats IR） 又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存 在于一个分子中,有时也有不完全相同的情况 RNA和DNA中都可能存在 此外还可有directed repeatitive sequence ---正向重复序列

C

反向重复序列间间隔较短或无间隔 反向重复序列间间隔较长

一些调控蛋白的识别位点 5‘－－GAATTC－－3’ 3‘－－CTTAAG－－5’ * 较短的回文序列可能是作为一种信号 * 较短的回文序列可能是作为一种信号 如：限制性内切酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点 例如限制性内切酶 EcoRⅠ的识别位点 5‘－－GAATTC－－3’ 3‘－－CTTAAG－－5’

可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关 2、三螺旋DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA) （1） 形成条件 一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链 如： polyA/polyU polydA/polydT polyd (AG)/polyd(CT) 可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关

（2） 组成形式 D.S. DNA + D.S.DNA T.S. DNA + S.S. DNA PolyT/A TTTTTTTTTTT （2） 组成形式 D.S. DNA + D.S.DNA T.S. DNA + S.S. DNA PolyT/A TTTTTTTTTTT AAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT AAAAAAAAAA

第三条链位于B-DNA的 Major groove中

3、 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ) 形成条件－－串联重复的鸟苷酸 5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’ 3’---AATCCCAATCCC-5’ Poly (G) 染色体端粒高度重复的 DNA序列 均有形成 四股螺旋DNA 的可能  已有实验结果表明－－真核细胞端粒中存在四链结构

可能的功能 A、 稳定真核生物染色体结构 5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT T A Hoogsteen Bonding 5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT 3’-----AATCCCAATCCC GGG T A B、 保证DNA末端准确复制 C、 与DNA分子的组装有关 D、 与染色体的 meiosis & mitosis 有关

第四节 DNA的物理、化学性质

是其结构和功能上的一个基本特征 也是DNA研究中一些实验技术的基础 PCR

一、DNA分子的变性 变性（denaturation 或融解 melting）：DNA双螺旋区的 氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这 一双链分离的过程叫做变性 1、条件：加热, 极端pH,有机溶剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等 2、变性过程的表现 ¤ 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很 窄的温度范围 ¤ 导致一些理化性质发生剧烈变化

表现为： ※ 熔液黏度降低 ※ 沉降速度加大 ※ 浮力密度上升 ※ 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，他在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升 天然DNA和变性DNA的吸收值相差可达34％ 当浓度为 50μg/ml时： D.S DNA A260 = 1.0 S.S DNA A260 = 1.37 dNTPs A260 = 1.60

3、熔解曲线与融解温度(Tm值) 缓慢而均匀地增加DNA 溶液的温度（现可做到 0.1 ℃／分）可根据各 点的A260值绘制成DNA 的熔解曲线 1.0 1.37 OD 1.185 Tm = OD增加值的中点温度(一般为85-95℃) 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度 ℃ 这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94 ℃的原因

1、 影响 Tm值的因素 （1） 在 A, T, C, G 随机分布的情况下 ，决定于GC含量 GC%愈高 → Tm值愈大 GC%愈低 → Tm 值愈小 （2）GC%含量相同的情况下 AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小 碱基排列对Tm值具有明显影响 5` GC 3` CG n 5` CG 3` GC n ＞＞ 136.12 ℃ 72.55 ℃ Tm 5` TA 3` AT n 5` AT 3` TA n ＜＜ 36.7 ℃ 57.02 ℃

Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking ※ 嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响 即－－氢键数目相同，但相邻碱基的堆积力不同 从嘌呤到嘧啶方向的碱基堆积力作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆积作用 Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking 5’ 3’ C G A T 5’ CA 3’ 3’ GT 5’

Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking 5’ 3’ C A T G 5’ AC 3’ 3’ TG 5’

 生物体内仅UAA为最有效的终止密码子 因为： UAA 的Tm值是最低的一个，即使生 理温度下也不稳定 AUU

（3） 大片段D.S DNA分子之间比较 片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关 （4） 小于100bp 的 D.S DNA分子比较 片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小 （5） 变性液中含有尿素，甲酰胺等 尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键 改变碱基对间的氢键 Tm 值可降至40℃左右 （6） 盐浓度的影响 每升0.18mol Na+是常用的标准条件 思考题：室温下蒸馏水中的DNA会如何？

酮基 → 烯醇基 改变氢键的形成与结合力 NH2 → NH2+ (质子化) 一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低 （7） 极端pH条件的影响 pH ~ 12 酮基 → 烯醇基 改变氢键的形成与结合力 pH ~ 2-3 NH2 → NH2+ (质子化) 一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低

2、 常用的变性方法 ☆ 热变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 ☆ 碱变性 pH11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 ◎ 保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L

二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation） 重新地合成双螺旋结构的过程（退火） Denaturation ▲ D.S DNA S.S DNA ▼ Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA )

0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除polydNTP 间的静电斥力 1、 影响DNA复性过程的因素 ：  阳离子浓度 0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除polydNTP 间的静电斥力 复性反应的温度 低于Tm值 25℃左右 (60-65℃)  S.S, DNA 的初始浓度 C0  S.S. DNA分子的长度（片段的大小） S.S. DNA愈长 S.S. DNA愈短 → 分子扩散愈慢 → 复性愈慢 → 分子扩散愈快 → 复性愈快 低温减少了互补链碰撞的机会，而且容易形成链内的二级结构，且错配的片段解开寻找正确的互补链也很困难  DNA 分子中, 碱基的排列状况 (随机排列, 重复排列)

3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’

二、C0t曲线－－复性发生过程的讨论  单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ） 包括两个因素：DNA的浓度（C，mol/L）和时间(s) 反应初始 t = 0 单链 DNA浓度 = C0 dCt / dt = KC02 反应达 t 时 单链DNA浓度 = Ct K＝复性速度常数

dCt / dt = KC02 积分 Ct / C0 = 1 / (1+KC0t ) 当 Ct / C0 = 1/2 时 Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2)) K = 1 / Cot(1/2) Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常数

Ct/C0是C0t的函数 按此公式作图得C0t曲线 Ct/C0 1 C0t(1/2) C0t

基因组的复杂性＝单一序列的长度＋重复序列的长度 基因组的复杂性(genomic complexity) 基因组的复杂性＝单一序列的长度＋重复序列的长度 复杂性的单位为核苷酸的数目 例如：含单一序列a, b, c, d 复杂性＝a+b+c+d 复杂性＝分子量 复杂性＝a+b+c+d 含106a, 103b, 10c, d 复杂性＜＜分子量

the more complex a DNA, the higher its Cot(1/2) 复杂性 1 :10－6 2×105 :0.4 2×109 :4000 * C0t和DNA的复杂性间存在线性关系： the more complex a DNA, the higher its Cot(1/2)

A "typical" mammalian C0t curve has three plateaus 真核生物的基因组由 高度重复（highly repetitive)序列、 中度重复（moderately repetitive or mid-repetitive) 序列 单一（single copy)序列组成 A "typical" mammalian C0t curve has three plateaus * C0t曲线能解释单一来源的DNA所具有的不同复杂性部分

四、富含A－T序列和DNA双螺旋结构的呼吸作用 很多有重要调节功能的的DNA区段都富含A·T （原核、真核－－ 复制起点、 启动子、终止子等区域） ●   DNA双螺旋结构的呼吸作用：DNA双螺旋结构内部， 配对碱基的氢键的迅速断裂和再生的过程 ●   DNA内富含A·T区段呼吸作用尤为明显 这对于某些特殊的蛋白质与DNA发生反应并阅读链内部的信息具有重要作用

第五节 超螺旋和拓扑异构

一、超螺旋（superhelix OR supercoil） ● 最早在SV40和多瘤病毒 中发现 ● 超螺旋是所有线性或环 形DNA的共有的重要特征 The supercoils of the SV40 minichromosome can be relaxed to generate a circular structure, whose loss of histones then generates supercoils in the free DNA.

导致左手超螺旋 1、 超螺旋结构的方向性 B-DNA 紧缠overwinding (右旋) 以一根绳子做实验： 1、 超螺旋结构的方向性 B-DNA 紧缠overwinding (右旋) 导致左手超螺旋 以一根绳子做实验： 原来的绳子的两股以右旋方向缠绕；在绳子的一端向紧缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个左旋的超螺旋以解除外加捻转的协变 正超螺旋（positive supercoiled ）

导致右手超螺旋 B-DNA 松缠unwinding (左旋) 在绳子的一端向松缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个右旋的超螺旋以解除外加捻转的协变 负超螺旋（Negative Supercoiled ）

超螺旋的形成总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展 所有生物的DNA几乎 有5%为 Negative Superhelix 二、超螺旋状态的描述 1、可用数学公式描述 Vinograd 方程式 L = T + W (α = β + γ)

W= 负值（negative superhelix） W = 正值 ( positive superhelix） L 连接数（Linking number ） 双链DNA的交叉数， 不发生链断裂时，L为定值 T 盘绕数（Twisting number ） 双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数 W 超盘绕数（Writhing number） 直观上为双螺旋在空间的转动数 W= 负值（negative superhelix） W = 正值 ( positive superhelix）

* B-DNA是 力学上稳定 的结构 ( 10 bp/ helix) * 螺旋数改 变的结果之 一是产生超 螺旋 或是在 B_DNA中保 *  螺旋数改 变的结果之 一是产生超 螺旋 或是在 B_DNA中保 留一单链区 域，但须能量的功给

B-DNA的变化情况： ＊ DNA在水溶液中, 构型偏B型状态 ＊ DNA以10.5 bp/helix为最稳定构型 但一些生命活动过程中存在正超螺旋

溴化乙锭（Ethidium bromide EB） 2、体外可产生正超螺旋 溴化乙锭（Ethidium bromide EB） 放线菌素D a、EB的插入只改变盘绕数T－－使其降低 但L值不变 base 3.4埃 EB 7.0埃 局部DNA的紧缩 W＝L－T L值不变 T值降低 W＝正值 产生正超螺旋

EB对超螺旋结构的影响 负 Superhelix    L不变,T减少  正 Superhelix 360o/helix 360o-26o/helix / 0ne of EB inserted

三、拓扑异构酶 拓扑异构体：只在连接数上有差别的同种DNA分子称为 这种DNA的拓扑异构体 拓扑异构酶（topoisomerase ）：催化DNA由一种拓扑异 构体转变成另一种拓扑异构体的酶类 拓扑异构酶的类别和特性 性质 Ⅰ型 Ⅱ型 原核生物 真核生物 被切割的DNA链 1 1 2 2 对ATP的需求 否 否 是 是 依赖于DNA的ATP酶 否 否 是 是 产生负超螺旋 否 否 是 否 松弛负超螺旋 是 是 否 是 松弛正超螺旋 否 是 是 是

L=3 L=2 改变超螺旋的方式 结果：连接数增加一个增加一个负超 1、拓扑异构酶Ⅰ (topoisomerase I) 共价连接 Tyrosine-5’P 切断一条链形成酶和DNA的复合体 结合到一条链上形成复合物 一条链穿越 重新连接 结果：连接数增加一个增加一个负超 L=2 L=3

2、拓扑异构酶Ⅱ －Top II 旋转酶(gyrase) TopⅡ亚类之一 引入负超螺旋 作用于双链 涉及双链的 断裂和连接 －－每次使DNA的连接数改变2

3、拓扑异构酶的生物学功能 a、恢复由一些细胞过程产生的超螺旋 如：复制叉前面正超的消除 转录酶前正超的消除，后面负超的产生 b、防止细胞DNA的过度超螺旋 多种拓扑异构酶的作用严格控制体内负超螺旋 维持在5%水平 所以－－ 一种拓扑异构酶的单向突变对细胞来说是致命的 因而一般两种拓扑异构酶的突变水平相当

复习题 1、名词解释 反向重复序列 DNA链的呼吸作用 Cot曲线 DNA变性 DNA的熔解温度 DNA复性 2、简答题 ＊ DNA是否唯一的遗传物质？ ＊ 如何确定DNA一级结构的方向性？ ＊ 决定DNA双螺旋结构状态的因素如何？ ＊ B-DNA中出现的大沟、小沟有何差别？ ＊ DNA结构多态性及其产生的原因。 ＊ 室温中蒸馏水中的DNA变化如何？为什么？ ＊ Ⅰ、Ⅱ型拓扑异构酶的作用方式和结果的情况