生殖医学研究进展 浙江大学医学院 黄荷凤

生殖医学的范畴 生殖医学是研究生殖细胞（配子）的发生、成熟、受精以及胚胎发育早期事件的科学。

主要涉及的学科 生殖生理学、胚胎学及发育生物学－揭示生殖奥秘 生物遗传学－发现生殖遗传规律 妇产科、计划生育学和男科学－直接生育调控的临床实践 生殖医学伦理学－判定生殖相关科研和临床活动的道德范畴

生殖医学基础研究重大突破－生殖细胞分化的调控 生殖领域的根本性问题 2006年，科学家们发现视黄酸可以引起减数分裂，而减数分裂开始的时间会决定一个发育中的生殖细胞是朝雄性还是雌性的方向发展。 Science：如果减数分裂在胚胎发育时发生，生殖细胞成为卵子；如果减数分裂被推迟到出生之后，生殖细胞则会成为精子。因此要发育成雄性胚胎，细胞中有一类维生素A降解酶——CYP26B1降解视黄酸，推迟减数分裂的时间。 PNAS：Jana Koubova等人也提出减数分裂成卵子还是精子的转换过程需要视黄酸基因8的刺激，这两个研究为实现调控干细胞发育成卵子或者精子提供一个方法。不正常的视黄素信号可能给生殖细胞以错误的指令, 这可能导致生殖细胞肿瘤的形成。

主要的临床和科研技术 避孕和节育技术－控制生育，将性与生殖活动相分离，有性而无新生命 辅助生殖技术－改变生殖生理过程获得新生命，无性而有生命 生殖克隆技术－通过配子和胚胎的改造，创立新的生殖方式并获非自然意义的新生命，无性＋无自然遗传规律＋最具争议的技术 干细胞及定向分化技术，组织工程技术－修复因疾病损伤的细胞、组织和器官－再生医学

试管婴儿之父、口服避孕药发明者、美国科学院院士、美籍华人生殖生理学家张民觉，曾三次被提名诺贝尔候选人。 清华－－剑桥－－美国伍斯特基金会实验生物学研究所

张民觉对生殖生理学的贡献 1959年，张民觉成功地实现了兔子的体外受精和胚胎移植，为人类IVF-ET的建立奠定了基础。 世界上第一个妇女口服避孕药的发明者之一。 1961年，FDA于正式批准厂商以Enovid商品名生产上市。 Nature，1959

科学明星们

动物明星们

辅助生育技术

辅助生育技术 辅助生育技术（ART）是指对配子、合子、胚胎 或基因物质的体内外系统操作而获 得新生命的技术。 ART主要包括二大部分： 体外授精(又叫人工受精， AI) 体外受精—胚胎移植 (IVF-ET）—核心部分

人工授精（AI） 人工授精具有悠久的历史， 1761年，SpaLLanzi成功地为母蛙人工授精， 1790年John Hunter为严重尿道下裂患者的妻子行配偶间人工授精获得成功， 1884年Willam pancoast首次施行非配偶间人工授精获得成功， 1890年John DicKinson开展了供者精液人工授精的临床服务。 1954年Bunge首次成功在用于冻精子作人工授精获得成功， 1986年Forrler报告腹腔人工授精获得成功。

人工授精的方法 AIH AID AIM IUI (Intrauterine insemination） IVI (Intravaginal insemination) ICI (Intracervical insemination) ITI (Intratubal insemination) IPI (Intraperitoneal insemination) IFI (Intrafollicle insemination)

辅助生育技术－IVF-ET 1978年，诞生了世界上第一例试管婴儿 Steptoe PC and Edwards Lancet，1978

This is the first time we’ve solved all the problems at once This is the first time we’ve solved all the problems at once. We’re at the end of the beginning--not the beginning of the end 我们一次性解决了所有的问题。我们的研究成功的开启了一个新纪元，并且远远没有结束。 --------Patrick Steptoe, 1978

IVF-ET成功的前期经典实验 19世纪后叶， Walter Heap （Proc R Soc）将兔子输卵管冲洗下的胚胎移植到另一兔子的子宫内，妊娠成功（同种移植） 20报世纪初叶，将一种动物输卵管冲洗下的胚胎移植到另一种动物的子宫内，妊娠成功的子宫内（异种移植） 1959年，Chang M C（Nature）将兔子的卵子和精子在试管内受精成胚胎，再移植该兔子的子宫内，妊娠成功。（IVF的起点）

配子输卵管内移植（GIFT） 1980年Kreitman和Hodgen开始研究灵长类的输卵管内卵移植术,他们用31只猴做实验,结果16%妊娠并分娩正常的子代。 1983年Tesarik等首次报告在显微外科手术治疗输卵管阻塞的同时行GIFT成功妊娠。 1984年，Asch等首次报道通过腹腔镜进行GIFT并在人体获得成功。

配子和胚胎冷冻保存技术 1984年，第一个冰冻后复苏的胚胎移植婴儿在英国出生。冷冻胚胎最长的记录目前是13年，为美国加州一名妇女胚胎冷藏在摄氏零下235度达13年之久。 目前,世界上已普遍开展了精子和胚胎的冷冻和复融技术,而卵子的冷冻和复融成功率较低,目前正在探索中。

植入前遗传性诊断技术 --PGD 指对胚胎或卵子行卵裂球或极体活检，作染色体和/或基因学检测，将无疾病胚胎植入子宫妊娠，并出生正常子代的技术。 使遗传物质剔除或导入成为可能 Natue,1990

PGD的历史 In 1968, Gardner and Edwards were able to sex rabbit Embryos using a sex-specific chromatin pattern in BLASTOCYST biopsies, before their transfer to the uterus. 1968年， Gardner 和Edwards在植入前胚泡活检中利用性染色体的特殊模式来区别兔胚胎的性别。 Nature 218, 346-349 (1968)

PGD的历史 1990年英国首先应用PGD－PCR扩增Y（－）的方法治疗X性连锁疾病（adrenoleukogysreopy), 获临床妊娠, but misdiagnosis ——Handyside, A. H., et,al. Nature 344, 768-770 (1990) 1992同作者应用X(+)方法治疗CF，获正常女婴出生。 ——Handyside, A. H., et,al. N. Engl. J. Med. 327, 905-909

未成熟卵体外成熟技术 1991年 cha等首次报道了从未刺激周期的卵巢中取到未成熟卵，经体外成熟、受精及胚胎移植，获得了妊娠成功。 IVM尽管取得了很大的进步，但仍然存在许多问题和不足：卵子成熟率低、成熟后卵子受精率低、种植率低、IVM卵子质量不能保证。 Fertil Steril 1991

单精子卵胞浆内注射技术 1992年比利时自由大学的Palermo等首次报道了通过ICSI（单精子卵胞浆内注射）技术成功妊娠并获出生新生儿。 显微操作技术在生殖医学应用的一大突破,使基因操作（改造）成为可能 Lancet,1992

卵子重建技术 核移植技术的应用，使制造卵子成为可能。 随着年龄的增长，女性卵母细胞存储数量减少，而且质量也下降。 通过转移GV期卵子核到一去核年轻妇女的未成熟卵子，经体外培养成熟，由此改善卵母细胞的质量。 但是线粒体具有独立于核DNA的线粒体DNA（mtDNA），移植后供者的mtDNA持续存在，因此大部分学者对这项技术持谨慎态度！

克隆技术、单性生殖技术

克隆技术 1997年，英国罗斯林研究所Ian Wilmut通过体细胞核移植技术，首次克隆世界上第一个克隆动物——多利羊 Ian Wilmut Natue,1997

再克隆技术 1998年，来自日英美意等国的科学家采用一种新克隆技术用成年鼠的体细胞成功培育出了多只克隆鼠，并获得了“克隆的克隆”的第二及第三代克隆鼠，祖、母、孙三代50余只克隆鼠，它们在基因构成上完全一致。 到目前，有报告称克隆鼠已经出现了第六代。 Natue,1998

克隆技术 2000年，美国俄勒冈地区灵长类动物研究中心的Anthony Chan成功利用胚胎分裂法复制两只名为Tetra及Andi的恒河猴 并非真正的克隆技术 Science 2000

克隆技术 2005年，韩国科学家黄禹锡宣布成功孕育出全球第一只克隆狗。 狗是最难克隆的动物之一，狗排卵较少，卵子不易取得，而且其卵子不会在试管里成熟。 Nature 2005

克隆技术-克隆胚胎干细胞系 2007年，美国俄勒冈州健康和科学大学首次克隆灵长类动物胚胎－猕猴胚胎。用取自不同猕猴的皮肤细胞和卵子培育出胚胎，并提取出两个干细胞系。 Natue,2007

单性生殖技术 2004年，来自两个卵母细胞的小鼠 使得哺乳动物的单性生殖成为可能 颠覆了自然界中哺乳类动物发育的核心机制 辉夜姬 Nature 2004

辉夜姬的印记校正机理 Step 1. 采用了一个成熟卵子和一个新生小鼠的未成熟卵子，胚胎发育至13.5天 Step 2. 再剔除未成熟卵子的H19基因，鼠胚胎发育至17.5天 Step 3. 剔除CTCF蛋白结合位点，最终在371个胚胎中有10个临产时看来正常，2个出生，一个即“辉夜姬” Loebel DA & Tam PPNature 2004

胚胎干细胞技术

胚胎干细胞技术研究进展 1981年，英国剑桥大学的Martin Evans和Matt Kaufmann以及加州大学旧金山分校的Gail Martin博士的实验室，分别自小鼠胚囊中分离出胚胎干细胞。 研究发现若利用微量注射方式将胚胎干细胞注入囊胚中，并使其发育成鼠，则胚胎干细胞便有能力发育成嵌合体小鼠身上的任何一个组织，随后并可造成基因剔除小鼠。

胚胎干细胞技术研究进展 1998年，美国威斯康辛大学的生物学家James Thomson首次分离、建成了第一个人类胚胎干细胞系 。

胚胎干细胞技术研究进展 2003年，日本物理化学研究所首次用猴胚胎干细胞生成两种末梢神经。 2003年，科学家成功从老鼠胚胎干细胞中培育出具有繁殖能力的卵子。 2004年5月，世界上首个国家胚胎干细胞库在英国伦敦建立。 2006年，用猪皮肤干细胞生成类卵细胞，并经孤雌激活生成胚胎。

胚胎干细胞技术研究进展 2003年，日本科学家首次将老鼠胚胎干细胞诱导成为精子。 2006年，英国利用从白鼠骨髓中提取的干细胞人工制造出精子，并成功地孕育出7只小老鼠。 精子活力差，需ICSI 成功率3.33% 子代严重异常，无生育力

人兽嵌和体 半兽人？？ 2004年，美国内华达大学诞生世界上 第一只人兽嵌合绵羊，它的体内含有15% 的人类细胞。 它在想人的事情？ 2004年，美国内华达大学诞生世界上 第一只人兽嵌合绵羊，它的体内含有15% 的人类细胞。 从病人的骨髓中提取干细胞，然后将其注入一只绵羊的胚胎中，羊的胚胎在发育过程中将与人的胚胎干细胞胚胎混合生长，人类干细胞会进入绵羊所有器官的循环系统。 半兽人？？

基于卵裂球克隆技术的 胚胎干细胞获取 Cell子刊 ：胚胎分裂成８细胞时从中提取一个细胞，使其与层粘连蛋白结合，进而将它们诱导成胚胎干细胞。 这种从分裂球中提取细胞的方法，类似于从体外受精后形成的胚胎中提取细胞进行基因检测的方法 面临的问题 胚胎活检技术对胚胎存在一定的损伤 常规的胚胎活检技术具有医学指征 为胚胎干细胞获取进行的胚胎活检不具有医学指征。

胚胎干细胞技术研究进展 2007年，美国和日本研究小组分别在《Science》和《Cell》杂志报告：将人体上提取的皮肤细胞注入特定基因，成功改造成类胚胎干细胞（IPS细胞，induced pluripotent stem cell ），在功能上和胚胎干细胞相类似。 James Thomson Shinya Yamanaka

IPS细胞 该技术利用反转录病毒为载体，将四个不同作用的关键基因转入体细胞内，使其变成一个多功能的干细胞，具有胚胎干细胞的特性； 日本研究组选择的基因：OCT3/4、SOX2、C-MYC和KLF4四种基因 ; 美国的小组选择的基因：OCT3、SOX2、NANOG和LIN28； 其中OCT3/4、SOX2这两个基因是相同的，但是C-MYC可能同时具有致瘤性。

IPS鼠 将这种诱导形成的胚胎干细胞（IPS细胞）注入小鼠胚胎，成功诞生IPS鼠 IPS鼠的基因与用来制造它的基因重组细胞在功能上一致

IPS细胞历史 2003年时，英国剑桥大学的 John Gurdon研究小组发现，如果将已完全分化的小鼠胸腺细胞注射至非洲爪蟾的卵母细胞时，卵母细胞会重新设定胸腺细胞并让其开始表现胚胎干细胞的特殊转录因子 - Oct4。这个结果开启了人类对体细胞转变成干细胞的研究。

IPS细胞历史 2006年8月，山中伸弥在小鼠尾尖成纤维细胞中引入四个转录因子基因，这样得到的新“皮肤细胞”具有干细胞的特性——能够分化出其他类型的细胞。可是，它们仍然和胚胎干细胞有着较大差异，也无法培育成鼠胚胎。 2007年6月，山中伸弥的实验室和美国哈佛干细胞研究所、怀特黑德生物医学研究所等机构相继发表了进一步的研究成果。这一次，科学家们还是用这4个基因，但是获得了真正多能性的干细胞，并且能够进入种系——将这些皮肤细胞植入早期胎儿小鼠，它们能和真正的胚胎干细胞一样发育，参与形成胎儿小鼠的身体各部分 。 四个多月后，两个实验室同时发布研究成果：山中伸弥从一位36岁妇女的脸部皮肤和一位69岁男性的结缔组织中提取细胞，而汤姆森选择的是胎儿皮肤细胞和一个新生儿的包皮细胞。

IPS干细胞最新研究进展 最近，美国科学家成功使IPS细胞分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞以及造血细胞。 用同样的方法，B淋巴细胞也被改造为IPS细胞。 Stem cell 2008 PNAS 2008 Cell 2008

IPS的优点 方法简单：只需要4个遗传因子就可以将皮肤细胞重新变回干细胞 突破了以往只能利用卵子和胚胎的取材限制 使用皮肤细胞最终能够让医生制造出带有病人特定遗传信息的干细胞，从而消除组织或器官移植后发生排异反应的风险 研究癌症、糖尿病及早老性痴呆症等疾病原理 干细胞可以让研究人员绘制出带病细胞的基因结构图，从而帮助找到治疗方案。它们还可以让研究人员对化学药品进行筛查，以确定能够治疗或治愈疾病的药物，这会大大加快能够挽救生命的药物投放市场的过程 应用这项技术，或许能通过皮肤细胞制造精子和卵子，这能帮助那些有生育问题的患者

IPS的缺点 干细胞转化的成功率非常低，而且由于使用了反转录病毒作为基因载体，会引发致癌基因的活性，在京都大学培育的老鼠中有20%产生了肿瘤 研究中用的“慢病毒”也会改写染色体的遗传信息 新获取的干细胞看起来与胚胎干细胞几乎一样，但是现在确定它们能否有着与胚胎干细胞相同的表现还为时尚早。  IPS鼠带有两套染色体 需要使用逆转录病毒来将4个遗传因子注入皮肤细胞内，这增加了细胞发生变异的风险。 此类风险使得这类干细胞暂时不会用于临床治疗。

胚胎干细胞和克隆技术的临床应用 ——治疗性克隆技术 胚胎干细胞和克隆技术的临床应用 ——治疗性克隆技术

治疗性克隆技术 从理论上讲，通过克隆技术用患者的体细胞培养出胚胎，再从中提取干细胞，这样获得的胚胎干细胞与病人具有同样的基因型，它所衍生出的细胞或组织植回病人将不会引起免疫排斥反应

治疗性克隆技术的研究进展 2002年3月，美国怀特黑德生物医学研究所借助克隆技术成功对实验鼠进行了胚胎干细胞治疗，首次在动物身上证实“治疗性克隆”技术是可行的。 科学家们从患有免疫缺乏症的实验鼠身上采集了皮肤细胞，然后利用其克隆出鼠胚胎，提取出鼠胚胎干细胞。这些胚胎干细胞在遗传上与提供皮肤细胞的实验鼠具有相同的缺陷。 他们接着利用基因治疗手段，在鼠胚胎干细胞中插入一种“ＨｏｘＢ４”基因。该基因能促进血细胞的增生。研究人员将经过修复的胚胎干细胞重新植入病鼠体内后发现，实验鼠的免疫系统功能得到了部分恢复。 Cell 2002

治疗性克隆技术研究进展 2003年4月，日本物理化学研究所宣布，在世界上首次用猴胚胎干细胞生成两种末梢神经，这一成果拓宽了再生医疗的前景。 2004年5月，世界上首个国家胚胎干细胞库在英国伦敦建立，它可为糖尿病、癌症、帕金森氏症和早老性痴呆等疾病的研究和治疗储存、提供干细胞。

治疗性克隆技术研究进展 2004年9月，美国马萨诸塞州细胞技术公司宣布，首次用人类胚胎干细胞成功培育出了视网膜细胞，该技术有望用于治疗视网膜退化造成的失明。 2005年1月，日本京都大学专家首次报告，将猴胚胎干细胞分化成神经干细胞，再植入6只患有帕金森氏症的猴子的脑部，结果它们的病情明显好转－治疗猴帕金森氏症。

治疗性克隆技术研究进展 2002年，人类胚胎干细胞部分定向分化成功。美国科学家首次将鼠胚胎干细胞诱导成为运动神经细胞。 2006年，美国威斯康辛大学工作的中国科学家成功用人类胚胎干细胞分化出运动神经细胞。 2006年，美国科学家将老鼠胚胎干细胞与特定化学物质相结合后，植入了“残疾老鼠”的脊髓内。在化学物质的引导下，这些干细胞在脊髓内定向成长为运动神经元，取代已经死亡的神经元，并在脊髓与腿部肌肉之间形成连接神经，让瘫痪的小鼠恢复了行走能力。

治疗性克隆技术研究进展 2007年12月4日，Rudolf Jaenisch等先通过对用基因敲除/敲入技术将小鼠的的a珠蛋白基因用人类的a珠蛋白基因代替，将小鼠的b珠蛋白基因则由人类的镰刀状贫血基因代替，培养出了镰刀状细胞贫血的小鼠模型。 取其小鼠皮肤成纤维细胞，通过导入Oct3/4,Sox2, Klf4，c-myc，最后获得疾病IPS细胞，然后用基因打靶技术，用正常基因代替疾病基因，再将健康IPS细胞诱导成造血细胞，将其移植到患镰刀型红细胞贫血的小鼠骨髓，干细胞成功地分化为合成正常血红蛋白的红细胞，最终将小鼠治愈。

基因打靶 基因打靶就是定点突变小鼠胚胎干细胞的某个特定基因，使之发育成为稳定携带这个突变基因的小鼠品系的一种基因转移和改造技术。 在1987年，马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯在基因打靶技术的研究上做出了开创性贡献。

治疗性克隆技术研究进展 由皮肤细胞中提取细胞核，移至鼠卵而培养出克隆胚胎，提取胚胎干细胞。 诱导其发展成可分泌多巴胺的神经元，然后将这些神经元移植至患有帕金森病的实验鼠体内。 总共有6只实验鼠接受了从自体皮肤细胞到最终的神经元移植，效果非常理想，移动行为测试分值均显示良好。 Nature Medicine 2008

总结 科技的发展不断刷新人类对自身的理解 干细胞和克隆技术是目前生命科学领域发展最前沿的技术 治疗性克隆真正应用于临床，还有很长的路要走