基因诊断与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 第二十八章 基因诊断与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy

本章内容提要 第一节 基因诊断学基础 第二节 遗传病的基因诊断 第三节 传染病的基因诊断 第四节 肿瘤的基因诊断 第一节 基因诊断学基础 第二节 遗传病的基因诊断 第三节 传染病的基因诊断 第四节 肿瘤的基因诊断 第五节 基因诊断在法医学上的应用 第六节 基因治疗的概念及策略

第一节 基因诊断学基础 Basis of Gene Diagnostics

基因诊断之父—简悦威 1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫血进行诊断。

一、基因诊断的概念、特点及临床意义 定义： 利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。

诊断依据(遗传物质改变) DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高； 基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。

基因诊断的特点 高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用广泛性

二、基因诊断中常用的分子生物学技术 核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断

（一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization 指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。

核酸分子杂交流程 待测核酸制备 核酸探针制备 滤膜上核酸固化 探针标记 杂交 加入标记探针 去除未杂交的探针 检测杂交信号

1. Southern 印迹杂交(Southern blotting) 提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。

2. Northern印迹杂交(Northern blotting) RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。

3. 斑点杂交（dot blotting） 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。

4. 反向斑点杂交 （reverse dot blotting） 先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。

(allele specific oligonucleotide, ASO） 等位基因特异性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO） 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。

5. 原位分子杂交 荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH） 挂锁FISH (FISH with padlock)

荧光原位杂交（FISH）

6. 固相夹心杂交法 (sandwich hybridization) 待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA片段（A、B片段），分别作为捕捉探针（不标记的A片段）和检测探针（标记的B片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。

固相夹心杂交法示意图

（二） 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR） 变性 模板 引物 dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶 延伸 退火

PCR在基因诊断中的应用 RT-PCR 荧光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO AS-PCR PCR-SSCP PCR-RFLP

1. RT-PCR

2. 荧光定量PCR 荧光标记引物

3. 多重PCR 多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR

N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因 4. PCR-ASO ASO1 ASO2 N H M N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因

（三）单链构象多态性分析 （single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。

PCR-SSCP分析原理示意

PCR-SSCP分析 － + 正常人 纯合突变 杂合突变

（四）限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。

PCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某 一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩 增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶 切片段长度变化，即可作出诊断。

EcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化 － － ＋ ＋ A B C D E F G GAATTC CTTAAG C +D D E E F F C

（五） DNA序列测定（DNA sequencing）

DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法)

序列分析用于基因诊断研究 左侧：正常；右侧突变

（六）生物芯片（biochips） 基因芯片（gene chips） 蛋白质芯片(protein chip)

基因芯片杂交流程示意图

基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法 优点与问题 解决方案 核酸分子杂交 结果可靠但操作繁琐 选择合适的探针 PCR 灵敏度、特异性高 设计合适的引物 SSCP 操作简便、检出率不高 选择合适的片段 RFLP 结果可靠但限制较多 选择合适的限制酶 DNA测序 可自动化，但不适宜广泛使用 与PCR配合使用 生物芯片 效率高，成本高，不适宜广泛使用 选择合适的芯片

三、 基因诊断技术路线与方法 根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。 直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常 间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析

（一）直接诊断途径 必要条件： ◆ 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 ◆ 被检基因正常分子结构已被确定 ◆ 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知

1.点突变的检测 （1）有限制性内切酶位点改变 5/— —3/ 3/— —5/ RFLP

（2）无限制性酶切位点改变 斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序 5/— —3/ 3/— —5/ 斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序

2. 基因重排的检测 在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。 核酸分子探针杂交与PCR

-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断 α2 α1 α2 -珠蛋白基因不同程度的缺失可引起 不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血 BamHI 14 kb α2 probe 10 kb -珠蛋白基因不同程度的缺失可引起 不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血

根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物 等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR） 根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物

3. 基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析

（二）间接诊断途径 1.采用原因 致病基因未知或基因结构不确定 致病突变机制不清 致病位点不便检测

2. 遗传标记 DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。

间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记 三代遗传标记： SNP(single nucleotide polymorphism) RFLP（基于核酸分子杂交技术） VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP(single nucleotide polymorphism)

N：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针 HBS的间接基因诊断 ——RFLP标记的连锁分析 N H P HapⅠ 7.6kb 正常 13kb 13kb 患者 7.6kb Southern印迹杂交 N：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针

第二节 遗传病的基因诊断 Gene Diagnosis of Hereditary Diseases

一、血红蛋白病（hemoglobinopathy） （一）镰状细胞贫血病 （二）β-珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（Hemophilia） 甲型血友病基因诊断 三、脆性X综合征

一、血红蛋白病 （一）镰状细胞贫血病 1.镰状红细胞贫血患者基因诊断——ASO杂交法 2.HBS的限制性内切酶谱分析 3.HBS的PCR-RFLP分析

1.镰状红细胞贫血患者基因诊断 ASO杂交法 正常的（N）的ASO探针： 5´-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3´ 突变的（M）的ASO探针： 5´-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3´

镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测 N-ASO M-ASO 正常 突变 突变 纯合子 杂合子 纯合子 斑点杂交结果 N：正常；M突变

× 2. HBS的限制性内切酶谱分析 MstⅡ酶切位点（CCTNAGG） 正常基因 突变基因 镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析 (CCT GAG G) 5´ 3´ 正常基因 1.15kb (CCT GTG G) × 5´ 3´ 1.35kb 突变基因 镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析 目 录

1.35kb 1.15kb 0.2kb 正常人 突变携带者 患者 镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析 目 录

3. HBS的PCR-RFLP分析 正常人 患者 杂合体 Marker 正常人的扩增产物经 Mst Ⅱ消化可生成54bp和56bp两个片段，而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带

（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症 1. PCR-RFLP分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段； 2：bA/ bA； 3：bA/ bT； 4：bT/ bT 注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在0.8％的琼脂糖凝胶中不易被观察到

-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析 2. 反向斑点杂交 -珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析

二、血友病（Hemophilia） 甲型血友病是由于血浆凝血因子VIII（FVIII）缺陷造成。 甲型血友病的基因突变类型已有300余种，其中点突变占174种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。

1. FVIII基因倒位的DNA印迹分析 将基因组DNA用Nco I，Dra I或Bcl I等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为21.5 kb、14 kb和16 kb三种类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14 kb三种类型；Ⅱ型倒位患者表现为20、16和15.5 kb三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。

2. FVIII基因突变的检测 （1）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析 （2）RFLP连锁分析 （3）VNTR分析 （4）短串联重复序列（STR）的连锁分析

三、脆性X综合征 脆性 X 智力低下基因1（FMR1）5ˊ非翻译区遗传不稳定的(CGG)n 三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻CpG 岛的异常甲基化。 正常人中约为 8～50 拷贝。 男性和女性携带者增多到52～200拷贝，相邻的CpG 岛未被甲基化，称为前突变（premutation）。 男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到200～1000拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（full mutation）。 全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，FMR1 mRNA在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。

脆性X综合征常用基因诊断方法 1．PCR-ASO 2．DNA连锁分析 3．Souhern印迹杂交法 4．PCR扩增

第三节 传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases 目 录

一、病毒性疾病 甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。 乙型肝炎病毒（HBV） 设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA，以便分型。 丙型肝炎病毒（HCV） HCV为正链RNA病毒，先反转录成cDNA，再进行巢式PCR检测HCV。 目 录

二、细菌引起的疾病 结核分枝杆菌 幽门螺杆菌（HP） 先设计一对特异性引物，用PCR技术扩增出一383 bp序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。 幽门螺杆菌（HP） 主要采用PCR技术：①检测HP染色体DNA特异片段；②检测HP尿素酶A基因；③用PCR-RFLP鉴别HP菌株。

三、寄生虫及衣原体感染 疟原虫 卡氏肺孢子虫 衣原体感染 诊断方法：核酸杂交和PCR技术

第四节 肿瘤的基因诊断 Gene Diagnosis of Malignant Tumors

一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌 结肠癌

一、原癌基因与抑癌基因的检测 1．原癌基因的检测 ras 基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、GTT或GAT，少数突变为GCT。 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。

2. ras原癌基因突变常用的检测方法 PCR 及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第12位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突变。 核苷酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因第12位密码子点突变。

3．抑癌基因p53的检测 p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、第273位及 第282位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53基因蛋白。 p53的基因诊断方法有 （1）PCR-SSCP分析技术 （2）DNA序列分析 （3）PCR-RFLP分析

二、常见肿瘤的基因诊断 （一）乳腺癌 1．乳腺癌常见基因变异 5%～10%乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（breast cancer gene）的突变。 BRAC1突变易致乳腺癌。突变分布于整个编码序列，没有明显的突变簇或突变热点。70%的缺失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。BRCA1在N端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌的高风险相关；而在C端截短则主要与乳腺癌高危有关。 BRCA2基因在30%～40%的散发性乳腺癌有杂合性缺失（LOH）。突变提高乳腺癌易感性。

2．乳腺癌基因诊断方法 （1）PCR法检测BRCA1基因突变 （2）荧光原位杂交（FISH）检测BRCA2基因扩增

二、常见肿瘤的基因诊断 （二）结肠癌 1.结肠癌常见基因变异 在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。 APC（adenomatous polyposis coli）是结肠癌发生过程中第一个突变基因。K-ras原癌基因突变也是结肠癌形成的早期事件。 DCC（deletion of colorectal cancer）基因失活是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因DPC4和MADR2也可能会因18q等位基因丢失而失活。 p53基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。 DNA修复基因也与结肠癌有关。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或hPMS2基因的突变所致的DNA错配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。

2．结肠癌基因诊断方法 （1）PCR-SSCP法：对腺瘤样息肉病人APC基因PCR-SSCP技术进行分析。 （2）异源双链PCR法：检测APC基因变异。 （3）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩短了的APC蛋白。

第五节 基因诊断在法医学上的应用 Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine 目 录

一、DNA指纹与多态性遗传标记 重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。 串联重复序列散在分布于染色体上。 重复单位6～25 bp长，称为小卫星DNA。 重复单位2～6 bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。

可变数目串联重复序列(VNTR) 人类染色体上小卫星DNA的高度可变区（HVR）是由头尾相连的串联重复序列（tandem repeat，TR）组成，TR的核心序列同源性很高，等位HVR的长度由于TR的重复次数不同而有很大的差别，具高度多态性。

（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP） 扩增片段长度多态 （amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP） DNA长度多态除可用Southern印迹杂交法检测外，还可以通过PCR扩增后电泳来检出。

1985年，英国遗传学家Jeffeys等人用TR的核心序列为探针进行RFLP分析时，检测到许多HVR，并产生相应的图谱，所得图谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类指纹那样的高度专一性，所以称其为DNA指纹图谱（DNA fingerprinting）。 Alec John Jeffreys Oxford, United Kingdom 目 录

人类DNA指纹图

二、DNA指纹与法医学诊断 个体识别和亲子鉴定： DNA指纹技术是从基因水平检测DNA的高度多态性，个体识别率高。 以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和HLA分型，个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统一认证。

法医案检中的基因诊断技术 VNTR（可变数目串联重复序列/小卫星）的核酸分子杂交分析 STR（短串联重复序列/微卫星）的PCR分析 SNP的基因芯片检测

1．单位点探针检测及PI值的计算 父权指数（Paternity Index，PI）值、父权相对指数或亲子关系概率值计算方法基本一致。 PI值表示争议父作为亲父比随机男人作为亲父的可能性大多少倍，PI值大于1表示倾向肯定父子关系，数值越大，可能性越大；等于0时表示排除父子关系。

2．DNA指纹图与亲权鉴定 多位点VNTR系统和DNA指纹图的电泳分离后片段数目较多，各等位基因频率分布的计算复杂，进行亲权鉴定和个体识别时匹配概率的计算影响因素较多，目前尚无一个公认的最合理的计算方法。 目前解决亲权纠纷最简单的办法是先在孩子DNA指纹图中找出非母片段并计数为P，然后分析争议父DNA指纹图，看P条非母带在争议父中出现多少条。

由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。 亲权鉴定与DNA指纹图 由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。

第六节 基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy 目 录

基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。 目 录

狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。 广义基因治疗： ①外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质； ②采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因； ③将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物； ④向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的。 目 录

本节内容提要 一、基因治疗的策略 二、基因转移技术 三、基因干预 四、基因治疗的应用研究 五、基因治疗的前景与问题 目 录

基因治疗分类 体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗 只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代

一、基因治疗的策略

（一）基因置换（gene replacement） 定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。

基因同源重组技术 定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。 基因同源重组技术又称为基因打靶(gene targeting） 细胞内基因同源重组的发生率很低。

（二） 基因添加（gene augmentation） 定义: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。 类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。

定义： （三）基因干预（gene interference） 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy) 定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。 应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。

自杀基因的作用机制

1.自杀基因系统 ☻TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。

2. 旁观者效应（bystander effect） 定义: “自杀基因”导入后，不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。

（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。

二、基因转移技术

基因治疗的两种途径 ex vivo 靶细胞 载体 目的基因 in vivo 目 录

基因转移(gene transfer)技术 1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移

1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体。

（1）反转录病毒 反转录病毒的结构及生活周期

反转录病毒前病毒的结构特点 两端各有一长末端重复序列LTR。 LTR由U3、R和U5三部分组成。 在U3内有增强子和启动子； U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； 在R内还有poly(A)加尾信号。 病毒有三个结构基因 gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； pol基因，编码反转录酶； env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。 含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点。

反转录病毒介导的基因转移系统 ——由两部分组成 反转录病毒介导的基因转移系统 ——由两部分组成 反转录病毒载体：其基因组为缺陷型，保留了病毒的包装信号ψ，而缺失病毒的包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源治疗基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。 辅助细胞株(如PA317)：由另一种缺陷型反转录病毒（即带有全套病毒包装蛋白基因，但缺失包装信号ψ的反转录病毒）感染构建而成。能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体包装，但本身却不能包装成辅助病毒颗粒。

Retroviral packaging system

反转录病毒载体的特点 ①反转录病毒包膜上env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 ②反转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。 ③前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。 ④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组反转录病毒载体）以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。

随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 反转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。

（2）腺病毒(adenovirus)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。

目 录

腺病毒的优点 基因导入效率高，对人类安全； 宿主范围广； 基因转导与细胞分裂无关； 重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注； 腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。 目 录

腺病毒载体缺点 不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖 快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。 宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 有两个环节可能产生复制型腺病毒。 靶向性差。

（3）腺病毒相关病毒载体 一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。 AAV Virus Particles

Structure of AAV Virus Genomic DNA REP：病毒复制基因, CAP：编码衣壳蛋白的基因 ITR：反向末端重复序列

AAV的特点 以潜伏感染为主； 病毒基因组与细胞共存； 只要宿主细胞正常，AAV基因表达被抑制而维持潜伏状态； 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。

AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13 目 录

AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段； 感染效率比反转录病毒载体低, 在40%~80%的成人中存在过感染; 可能会引起免疫排斥。

常用基因治疗载体 整合 致病性 感染细胞 克隆容量 反转录病毒 载体 随机整合，效率高 可能致病 分裂细胞 <7kb 腺病毒载体   整合 致病性 感染细胞 克隆容量 反转录病毒 载体 随机整合，效率高 可能致病 分裂细胞 <7kb 腺病毒载体 不整合，可能丢失 不致病 分裂细胞、非分裂细胞 腺相关病毒载体 定点整合(19号染色体特定区域) <5kb <7.5kb

2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。

脂质体介导的基因转移示意图 目 录

（2）受体介导转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。

受体介导转移技术示意图 目 录

不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 （3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。

基因直接注射法的优点 制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。

三、基因干预 （gene interference）

（一）反义RNA（antisense RNA） 1. 反义RNA与基因表达调控

反义RNA的关键技术问题 ☻专一性转移问题 ☻反义RNA进入靶细胞前的降解问题

2.受体介导反义RNA技转移术 借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义RNA转移。

受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。 （l）安全性高 （2）反义RNA设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （4）能直接作用于一些RNA病毒

（二）核酶 (ribozyme) 天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子而达到治疗疾病的目的。

核酶锤头状的二级、三级结构 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。 目 录

1.核酶的设计 核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。 （1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。 （2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。

核酶的作用机制

2.核酶的应用 与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。

（三）干扰RNA 1.RNA干扰现象 RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。有义RNA（sense RNA）或反义RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。

2.RNA干扰的机制 RNA干扰过程主要有2个步骤： （1）小干扰性RNA（siRNA） 长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21~23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA） （2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。 该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断

RNA干扰机制示意图

研究基因功能的新工具  由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。   RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段。

siRNA的产生 1. 体外化学合成; 2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。

四、基因治疗的应用研究

（一）遗传病的基因治疗研究 (一)遗传病基因治疗必须符合以下要求 2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传； 3.该基因的表达不需要精确调控； 1.在DNA水平明确其发病原因及机制； 2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传； 3.该基因的表达不需要精确调控； 4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用； 5.该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述4条以上要求的不过只有30余种遗传病。 （一）遗传病的基因治疗研究

腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症 珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 血友病和其他血浆蛋白缺乏症 苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征 家族性高胆固醇血症 囊性纤维化病 目 录

（二）恶性肿瘤基因治疗研究 肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。 （1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移； （2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用； （3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应； （4）通过导入“自杀基因”杀伤癌细胞。

☻基因干预技术：通过基因干预，抑制肿瘤细胞中过度表达的癌基因，从而降低其恶性表型。 ☻自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞。 肿瘤基因治疗的常用方法 ☻基因干预技术：通过基因干预，抑制肿瘤细胞中过度表达的癌基因，从而降低其恶性表型。 ☻自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞。 ☻肿瘤的免疫基因治疗：激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。 ☻提高化疗效果的辅助基因治疗： 药物增敏基因治疗； 耐药基因治疗。

自杀基因治疗 自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。 基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地使转染了“自杀基因”的肿瘤细胞“自杀”。

肿瘤的免疫基因治疗 激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。 主要包括： 细胞因子（或受体）基因治疗； 抗原抗体基因治疗。

临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题： （1）患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交叉耐受，最终导致化疗失败。 （2）大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。

提高化疗效果的辅助基因治疗 药物增敏基因治疗： 为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。

耐药基因治疗： 肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶： 多药耐药（mdr-1）基因编码的P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白（MRP）以及肺耐药相关蛋白等； 细胞内氧化和解毒作用的酶系统： 细胞色素P-450（cytochrome P-450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等。 向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基因，增强骨髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。

（三）病毒性疾病的基因治疗研究 据统计，75%的人类传染病是由病毒引起的。病毒感染人体后不仅可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病也存在一定的关联。 临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，在众多开展的抗病毒治疗方案中，抗病毒基因治疗十分引人注目。

1．调节机体免疫应答 （1）将细胞因子(如干扰素、白细胞介素等)的基因，导入机体免疫细胞，激活免疫细胞并促进其增殖分化，增强机体的细胞和体液免疫应答，促进机体清除病毒感染的细胞和游离病毒。 （2）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，导入机体，表达的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以引发特异性的细胞免疫应答，产生对野生型致病病毒攻击的防御作用。

2.抗病毒复制：根据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计的 主要包括： （1）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。 （2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。 （3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。 （4）RNA干扰技术。 （5）将抗病毒蛋白质基因，如2'→5'腺苷酸合成酶等基因，导入细胞并持续表达，可以激活核酸酶F，降解病毒RNA。

五、基因治疗的问题与展望 治疗基因调控元件的选择 安全高效载体的构建和转移技术的选择 靶细胞的选择

谢谢！