定位、分离和鉴别影响猪脂肪沉积性状的硬脂酰辅酶A去饱和酶 (SCD) 基因 Christoph Knorr, Bertram Brenig 江西农业大学 定位、分离和鉴别影响猪脂肪沉积性状的硬脂酰辅酶A去饱和酶 (SCD) 基因 任军，黄路生，丁能水，艾华水，郭源梅， Christoph Knorr, Bertram Brenig

内容 引言 基因定位 基因分离 多态标记鉴别 相关性分析

引言 - 瘦蛋白（leptin）基因的发现 Leptin缺失型小鼠(ob/ob): -肥胖表型 Leptin: 左: ob/ob 小鼠 -调节体重和能量代谢平衡 - 减少 采食量 - 促进能量消耗和脂肪代谢 左: ob/ob 小鼠 右: 正常小鼠 Zhang, Science, 1994

引言 -leptin 基因和 SCD 基因的互作 SCD缺失型小鼠(abJ/abJ) 在高脂肪日粮的饲养条件下仍表现出清瘦的表型 Ntambi, PNAS, 2002

引言 -leptin 基因和 SCD 基因的互作 ob/ob (bottom)× abJ/abJ Double mutant mouse lean ob/ob (bottom)× abJ/abJ Double mutant mouse (ob/ob, abJ/abJ; top) SCD 是Leptin代谢通路中的重要调控元件，Leptin通过下调SCD酶活性抑制肥胖表型 Cohen, science, 2002

引言 -SCD 在脂肪代谢中的调控作用 硬脂酰辅酶A 棕榈酰辅酶A SCD 油酸 棕榈酸 饱和性脂肪酸与不饱和性脂肪酸的比率 细胞膜的通透性 oxidation 油酸 棕榈酸 饱和性脂肪酸与不饱和性脂肪酸的比率 细胞膜的通透性 甘油三脂的成分 信号传导 肥胖

引言 -SCD 在脂肪代谢中的调控作用 多不饱和性脂肪酸合成的限速酶 Leptin代谢通路中的重要调控元件 哺乳动物脂肪沉积性状的重要侯选基因

基因定位 -鼠/猪体细胞杂种克隆板的扫描 M 16 27 23 21 M M M SSC14G

基因定位 -鼠/猪辐射细胞杂种克隆板的扫描 10 12 18 19 26 P N 28 44 45 46 48 51 P N 57 60 62 68 69 72 75 77 86 90 92 95 96 99 100 112 114 115 P N

基因定位 -鼠/猪辐射细胞杂种克隆板的扫描 连锁群 SW2122-SW361-SW328-SCD-S0007-SW1333-SW2507-SWR1042-SW886 . 最紧密连锁的标记:猪14号染色体的S0007 (17cR, LOD 16.83)

基因定位 -鼠/猪辐射细胞杂种克隆板的扫描 SSC14q26-27

基因定位 -PAC基因组DNA文库的筛选 SSP SP PP Plate 4 signals 3 signals 1 signal TAIGP714 K1477Q Plate

基因定位 -荧光原位杂交分析 SSC14q27

基因分离 -PAC 克隆的酶切和杂交 Southern 杂交 KF/LR-114bp AF/BR-591bp 9 条阳性杂交带含有 SCD 基因片段

基因分离 -亚克隆和序列拼接 1 2 3 4 5 6 Primer walking HindIII-9.0 kb SacI-2.4 kb XbaI-5.7 kb BamHI-3.7kb HindIII-3.2 kb BamHI-5.1 kb SacI-8.0 kb XbaI-1.8 kb KpnI-1.7 kb Ex3-Ex4-1.6 kb Ex4-Ex5-1.7 kb Ex5-In5-0.5 kb

基因分离 -全长cDNA的分离 采用 5 /3 RACE 策略分离SCD基因全长cDNA ORF: 1080 bp 蛋白质: 359 aa 大小: 5134 bp; 超长的3’ UTR ORF: 1080 bp 蛋白质: 359 aa Motif: 2 poly(A) 加尾信号 3 mRNA 非稳定基序 (AUUUA)

Histidine motif: essential for oxidation (HXXXH; HXXHH)

基因分离 -哺乳动物SCD酶的进化树

基因分离 -基因的详细结构 转录单元: 16,186 bp 外显子-内含子：遵循 GT-AG 剪接法则 SCD mRNA 1 2 3 4 5 6 ATG TGA 转录单元: 16,186 bp 外显子-内含子：遵循 GT-AG 剪接法则 6 个外显子，长 131 bp - 4048 bp 5 个内含子，长 518 bp - 4784 bp

基因分离 -启动子预测 TATA box NF-1 SP1 NF-Y SRE PUFA-RE C/EBP 1 2 3 4 5 6 P ATG TGA P -500 -400 -300 -200 -100 +1 TATA box NF-1 SP1 NF-Y SRE PUFA-RE C/EBP

基因分离 -GC含量和CpG岛的预测 1 2 3 4 5 6 20,985 bp CpG

基因分离 -重复序列元件 13 SINEs 1 GC_rich element 2 LINEs 1 AT_rich element 1 LTR

基因分离 -表达分析 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N M SCD β-actin 广谱表达

多态标记鉴别 1 2 3 4 5 6 ATG TGA P CAG Insertion 24 bp insertion

多态标记鉴别 24 SNPs : 19 为转换突变 没有发现错义突变的 cSNPs 猪 SCD 编码区在各猪种间高度保守 1 2 3 4 5 6 ATG TGA P CAG Insertion 24 SNPs : 19 为转换突变 没有发现错义突变的 cSNPs 猪 SCD 编码区在各猪种间高度保守

多态标记鉴别 -等位基因频率 Polymorphism Breed Number Allele Frequency C T C-233T Landrace 110 0.009 0.991 Large White 133 0.049 0.951 Duroc 144 0.538 0.462 Luchuan 57 1.000 0.000 Huai 60 0.983 0.017 Erhualian 76 0.901 0.099 C641T 99 0.990 0.010 0.950 0.050 0.500 0.614 0.386 73 0.918 0.082

相关性分析 白色杜洛克 x 二花脸资源家系群体 -实验动物与性状 位点: SNP C(-233)T; C(641)T 性状: 240日龄体重的肩部、胸部、腰部、臀部 的四点背膘厚、板油重、花油重、腹脂重

相关性分析 -结果 C641T Polymor-phism Geno-type No LFW (g) VFW BFW BF a (cm) BF b (cm) BF c (cm) BFd (cm) BF e (cm) C641T CC (X±SD) 80 3551.3 ± 107.38 1718.4 45.55 1778.8 32.79 4.94 0.093 3.79 0.104 3.01 0.088 3.13 0.096 3.717 0.086 CT 39 3366.5 154.10 1703.6 65.37 1796.1 47.06 5.22 0.133 4.23 0.149 3.40 0.126 3.39 0.138 4.060 0.123 t-value 0.9815 0.1847 -0.3026 -1.7511 2.3967 -2.5342 -1.5410 -2.2814 P-value 0.3284 0.8538 0.7628 0.0826 0.0181 0.0126 0.1261 0.0244 (%) 0.1824 0.0324 -0.0451 -0.3428 -0.4722 -0.4943 -0.3044 -0.4683

相关性分析 -讨论 -SNP C641T 只与背膘厚相关联 -为种猪背膘厚性状的遗传改良提供了新的标记手段 - SNP C641T与临近染色体区域的背膘厚QTL呈连锁 不平衡，导致相关性的出现 -下一步的工作： 大样本和单倍体型分析 目的染色体区域的QTL定位

本项研究工作的3篇学术论文相继发表于国际SCI刊物Gene和Animal Genetics，申请国家发明专利1项。 相关性分析 -讨论 -SNP C641T 只与背膘厚相关联 -为种猪背膘厚性状的遗传改良提供了新的标记手段 - SNP C641T与临近染色体区域的背膘厚QTL呈连锁不平衡，导致相关性的出现 -下一步的工作： 大样本和单倍体型分析 目的染色体区域的QTL定位 本项研究工作的3篇学术论文相继发表于国际SCI刊物Gene和Animal Genetics，申请国家发明专利1项。

致谢 Thank you ! Prof. Dr. Dr. Lusheng Huang Prof. Dr.Dr. Bertram Brenig 其他南昌和哥廷根的同事 Thank you !