Address: 1500 Zhang Heng Road, Shanghai 201203, China 中药整体质量控制的方法研究和趋势 上海市食品药品检验所 季 申 2013.04 Address: 1500 Zhang Heng Road, Shanghai 201203, China Email: jishen2008@gmail.com 1 1

报告内容 整体控制中药质量的必要性 应用一测多评等技术的问题和解决方案 整体控制中药质量的展望

中药整体质量控制的必要性 中药的特点 中药成分复杂难以全面控制全部成分 同品种不同生产企业的生产设备难以完全一致 药材是天然产品，难以保证质量完全一致 值得肯定的是：企业对产品的安全性的重视，大部分中药有一定 的有效性和安全性，积累了很多的临床和实践经验。 中药如何寻求平衡？中药的前景？如何研究的思路？ 思考：

中药整体质量控制能够反映中药内在质量的整体变化情况和质量的均一程度，确保中药质量的均一稳定。 中药整体质量控制的必要性 中药质量控制的发展历程及趋势 发展历程 缺乏专属性控制指标 单一成分到多成分的控制 指标成分到有效成分的控制 发展趋势 从局部控制到整体控制 多成分定量结合指纹图谱的全方位中药质控新模式 中药质量控制面临的问题及解决方案 面临的问题 中药成分的复杂性 方法的专属、可控、实用和经济 有效性与安全性指标的合理设置 解决方案 物质基础的深入研究 实现合理全面的质量控制 中药整体质量控制能够反映中药内在质量的整体变化情况和质量的均一程度，确保中药质量的均一稳定。

应用一测多评等技术的问题和解决方案 物质基础研究必要性 制约中药发展的瓶颈---易导致药效作用机理,不良反应发生等机制阐述不清 建立全面可控的质量标准的基础---建立更科学、合理、有效的质量控制标准 中药技术提升的关键---更好地阐明中药作用机制等问题，促进中医药理论创新及新药的研发

中药注射液质量控制的模式(案例1） 有效地控制中药注射液内在的质量，运用高效液相色谱法、质谱法等技术手段，将阐明的化学成分纳入质量控制体系! 阐明注射液总固体中的成分 黄芩 熊胆粉 山羊角 金银花 连翘 明确5味提取物的物质基础 明确注射液总固体含有的大类成分和单体成分 建立专属性的分析方法 方法学认证 补上处方！ 注射剂质量标准 提取物质量标准 药材质量标准 保证中药注射剂的安全性、稳定性、有效性 有效地控制中药注射液内在的质量，运用高效液相色谱法、质谱法等技术手段，将阐明的化学成分纳入质量控制体系!

黄芩提取物 研究方法 研究成果 HPLC法 柱层析分离 Q-TOF液质 NMR等手段 明确了8个成分 建立了5种成分含量的专属 性测定方法 研究方法 研究成果 HPLC法 柱层析分离 Q-TOF液质 NMR等手段 明确了8个成分 建立了5种成分含量的专属 性测定方法 5种成分含量约为干燥提取物的98%

黄芩提取物的物质基础的研究 明确了黄芩提取物中的8个成分 黄芩提取物中约98％成分已明确结构,基本阐明了黄芩提取物的物质基础。 1 野黄芩苷 3 4 6 2 7 8 1 5 1 野黄芩苷 5,6,4’-OH；7-O-Glucuronic acid 2 黄芩苷 5,6-OH；7-O-Glucuronic acid 3 千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷 5-OH；6-OCH3 ；7-O-Glucuronic acid 4 白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷 5-OH；7-O-Glucuronic acid 5 汉黄芩苷 5-OH；8-OCH3；7-O-Glucuronic acid 6 黄芩素 5,6,7-OH 7 汉黄芩素 5,7-OH；8-OCH3 8 千层纸素A 5,7-OH；6-OCH3 黄芩提取物中约98％成分已明确结构,基本阐明了黄芩提取物的物质基础。

金银花提取物 研究方法 研究成果 HPLC（UV) HPLC-氨基柱 高效液相色谱－串联质谱HPLC 分离得到4个已知化合物 研究方法 研究成果 HPLC（UV) HPLC-氨基柱 高效液相色谱－串联质谱HPLC 分离得到4个已知化合物 明确了11个化合物结构 有机酸类成分约为干燥提取物的28 % -39%

金银花提取物物质基础的研究 明确了金银花提取物中的11个成分 金银花提取物中有机酸类成分占28％-39％。 1、新绿原酸 2、绿原酸 3、隐绿原酸 4、未指认 5、咖啡酸 6、獐牙菜苷 7、裂环马钱氧苷 8、木樨草苷 9、3,4-二咖啡酰奎尼酸 10、3,5-二咖啡酰奎尼酸 11、4,5-二咖啡酸奎尼酸 12、咖啡酸乙酯 8 910 11 12 1 2 3 4 5 6 7 金银花提取物质谱总离子流图 金银花提取物中有机酸类成分占28％-39％。

连翘提取物 研究方法 研究成果 HPLC –DAD 多波长 HPLC –蒸发光检测器 分离得到2个已知化合物 HPLC –离子阱质谱 研究方法 研究成果 HPLC –DAD 多波长 HPLC –蒸发光检测器 HPLC –离子阱质谱 HPLC –QTOF质谱 HPLC –示差检测器 UV 分离得到2个已知化合物 建立12种成分含量测定方法 小分子成分约占提取物10% 黄酮类成分约占提取物44%

连翘提取物物质基础的研究 明确了连翘提取物中的12个成分 小分子成分总量约占干燥提取物近10%。 1、连翘酯苷E 2、连翘酯苷D 3、咖啡酸 4、组峰（连翘酯苷C及其同分异构体） 5、连翘酚1（连翘酯苷A 的同分异构体） 6、芦丁 7、异连翘酯苷A（连翘酯苷A 的同分异构体） 8、连翘酯苷A 9、suspensaside A的同分异构体 10、suspensaside A的同分异构体 11、suspensaside A 12、连翘苷 小分子成分总量约占干燥提取物近10%。

在蓝圈处咖啡酰基取代位置发生互换，或空间上立体构型发生变化，都会产生异构体。 连翘酚1（C29H36O15） 连翘苷（C27H34O11） 连翘酯苷C及其同分异构体（C29H36O16） 在蓝圈处咖啡酰基取代位置发生互换，或空间上立体构型发生变化，都会产生异构体。 芦丁(C27H30O16) suspensaside A及其同分异构体（C29H34O15）

山羊角提取物 研究方法 研究成果 高效液相色谱法 高效液相色谱柱前衍生法 液质联用同位素内标法 高分辨率质谱 得到31种氨基酸 研究方法 研究成果 高效液相色谱法 高效液相色谱柱前衍生法 液质联用同位素内标法 高分辨率质谱 得到31种氨基酸 建立12种氨基酸的检测方法 蛋白氨基酸约为干燥提取物的70% 存在焦谷氨酸

11种蛋白氨基酸和焦谷氨酸的总量约占注射液总固体量的15%。 山羊角提取物物质基础的研究 明确了山羊角提取物中的11个成分 1、天冬氨酸 2、谷氨酸 3、丝氨酸 7、缬氨酸 8、苯丙氨酸 9、异亮氨酸 10、亮氨酸 11、脯氨酸 4、甘氨酸 5、苏氨酸 6、丙氨酸 焦谷氨酸 11种蛋白氨基酸和焦谷氨酸的总量约占注射液总固体量的15%。

熊胆粉提取物 研究方法 研究成果 红外 核磁 主要成分为熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸 制备薄层 上述两种成分总量占干燥提取物90％以上 研究方法 研究成果 红外 核磁 制备薄层 高分辨率质谱 HPLC（UV和 ELSD） 主要成分为熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸 上述两种成分总量占干燥提取物90％以上

熊胆粉提取物物质基础的研究 熊胆粉提取物 注射液 注射液与熊胆粉提取物共有成分为熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸, 两者总量约占注射液总固体量的33%。

国食药监注[2007]743号文件《关于印发中药、天然药物注射剂基本技术要求的通知》 总固体的80％成分可测 总固体的60％成分明确结构并采用专属性方法可测 明确结构成分中的90％在指纹图谱中可指认

阐明的物质基础和质量控制已满足国家的有关技术要求 注射液物质基础研究结果 A：总固体中可测成分 B：总固体中明确结构并采用专属性方法可测成分 C：明确结构并可在指纹图谱中指认成分 阐明的物质基础和质量控制已满足国家的有关技术要求

注射液指纹图谱 1、新绿原酸； 2、绿原酸； 3、隐绿原酸； 4、咖啡酸； 5、3，4’－二咖啡酸酰奎尼酸 6、3，5’－二咖啡酸酰奎尼酸 1、新绿原酸； 2、绿原酸； 3、隐绿原酸； 4、咖啡酸； 5、3，4’－二咖啡酸酰奎尼酸 6、3，5’－二咖啡酸酰奎尼酸 7、4，5’－二咖啡酸酰奎尼酸； 8、连翘酯苷D； 9、野黄芩苷 指纹图谱1 1、野黄芩苷； 2、黄芩苷； 3、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷 4、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷 指纹图谱2

注射液指纹图谱 可指认成分达到 明确结构成分的93％ 1、天冬氨酸； 2、谷氨酸； 3、丝氨酸； 4、甘氨酸； 5、苏氨酸； 6、丙氨酸； 1、天冬氨酸； 2、谷氨酸； 3、丝氨酸； 4、甘氨酸； 5、苏氨酸； 6、丙氨酸； 7、缬氨酸； 8、苯丙氨酸； 9、异亮氨酸； 10、亮氨酸； 11、脯氨酸 指纹图谱3 熊去氧胆酸 鹅去氧胆酸 可指认成分达到 明确结构成分的93％ 指纹图谱4

一测多评技术在中药质量控制中的应用 什么是“一测多评”（QAMS）？ 在多指标( s，a，b，…) 质量评价时，以某一典型有效成分作为内参物( s) ，建立内参物与其它待测成分( a，b，…） 间的相对校正因子( RCF，fsa，fsb…) 通过相对校正因子达到测定一个成分( 对照品可得到者)的同时 , 可计算出其它待测有效成分的含量

金银花提取物中总有机酸含量的主要方法学研究（案例2） 采用“一测多评”的理由： 物质基础研究表明： 具有7种有机酸类：金银花提取物中含绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、新绿原酸、4，5－二咖啡酸酰奎尼酸、3，4－二咖啡酸酰奎尼酸、3，5－二咖啡酸酰奎尼酸共7种有机酸 标准品的缺乏：除咖啡酸和绿原酸具有标准品外，其余标准品缺乏 具有绿原酸的母核：除咖啡酸外，其余6种有机酸结构类似，均具有绿原酸的母核 含量范围相近：含量范围为0.02～0.07mg/ml 内参物的选择依据：具有相同母核的有机酸---绿原酸

HPLC 分析方法的研究 波长的选择（金银花中的有机酸类最大吸收波长均在325nm ） 流动相组成的考察 流动相梯度的考察 柱温及流速的考察 不同色谱柱的考察 不同仪器的考察 时间 （分钟） 流动相A（％） 乙腈 流动相B（％） 0.1％甲酸 流速 （ml/分钟） 0～20 5→10 95→90 0.8 20～30 10 90 30～35 10→18 90→82 0.8→1.0 35～60 18 82 1.0 列出明确的内容？？ 方法中明确了色谱柱等可能影响相对保留时间的因素 方法允许流动相比例可以调节，并保证分离效果，以适应中药材批次间的合理差异

金银花提取物中有机酸类成分占28％-39％ 金银花提取物色谱峰指认 金银花提取物高效液相色谱图 咖啡酸 隐绿原酸 3，5’－二咖啡酸酰奎尼酸 4.5’－二咖啡酸酰奎尼酸 3，4’－二咖啡酸酰奎尼酸 新绿原酸 金银花提取物高效液相色谱图 金银花提取物中有机酸类成分占28％-39％

相对校正因子的确定需要大量，全面的数据考察 新绿原酸 隐绿原酸 3，4－二咖啡酸酰奎尼酸 3，5－二咖啡酸酰奎尼酸 4，5－二咖啡酸酰奎尼酸 标曲1 0.972705 0.976662 1.210966 0.989562 1.109981 0.969858 0.980694 1.214659 0.991608 1.108442 0.974806 0.979967 1.216515 0.991888 1.089856 0.978463 0.982519 1.2124 0.988588 1.072472 0.980724 0.982698 1.209252 0.985758 1.062248 0.985066 0.983805 1.202637 0.974812 1.049078 1.003118 0.975104 1.144151 0.924648 1.000802 标曲3 0.938677 0.978821 1.227598 0.940728 1.059597 0.947288 0.984169 1.234761 0.937337 1.038846 0.951752 1.001544 1.223393 0.935362 1.026517 0.953044 0.979194 1.214085 0.92938 1.024854 0.951453 0.995456 1.211917 0.92408 1.013441 标曲2 0.91463 1.114414 1.199906 1.004648 1.126698 0.935693 1.121086 1.208441 0.993484 1.120812 0.990339 1.082614 1.210835 0.957829 1.13294 0.982203 1.069526 1.194141 0.945644 1.128001 0.993901 1.076368 1.186283 0.933524 1.110371 平均 0.97 1.02 1.21 0.96 1.07 相对校正因子的确定需要大量，全面的数据考察 不同浓度范围 不同来源或批号的标准品考察 不同仪器的考察 以17个相对校正因子的平均值作为各有机酸成分的相对校正因子

待测目标色谱峰的定位（保证QAMS法应用的前提） 避免不同批次样品中除目标色谱峰外杂质峰的影响 避免目标色谱峰的相对保留时间漂出标准规定的范围（±5） 采用指纹图谱指认峰的方法实现目标峰的确认（峰1、3、4、5、7、8、9） 1、新绿原酸 2、连翘酯苷D 3、绿原酸 4、隐绿原酸 5、咖啡酸 6、野黄芩苷 7、3，4－二咖啡酸酰奎尼酸 8、3，5－二咖啡酸酰奎尼酸 9、4，5－二咖啡酸酰奎尼酸 指纹图谱 含量测定图谱 考察不同色谱柱，不同仪器的影响 结合DAD光谱、指纹图谱（特征图谱）等多种方式对待测目标色谱峰以相对保留时间进行指认

一测多评计算结果与实测结果表（单位：mg/ml） 其他方法学考察 准确度、精密度、专属性、定量限、检测限、线性范围、耐用性等，外标法和一测多评法结果的比较。 一测多评计算结果与实测结果表（单位：mg/ml） 编号 实际测得 总量 一测多评 计算结果 相对偏差 （%） 计算总量 1-1 0.238724 0.239490 0.16 8－1 0.235502 0.236156 0.14 1-2 0.237339 0.238098 8－2 0.234404 0.235058 2-1 0.208924 0.209694 0.18 9－1 0.230670 0.233377 0.58 2-2 0.211470 0.212247 9－2 0.236778 0.237503 0.15 3-1 0.221436 0.222297 0.19 10－1 0.240573 0.241209 0.13 3-2 0.221760 0.222625 10－2 0.239085 0.239723 4-1 0.239432 0.240241 0.17 11－1 0.256419 0.257009 0.12 4-2 0.236437 0.237233 11－2 0.254789 0.255352 0.11 5-1 0.236721 0.237321 12－1 0.252333 0.253086 5-2 0.236987 0.237591 12－2 0.252409 0.253187 6－1 0.204348 0.201665 0.66 13－1 0.237117 0.237748 6－2 0.203957 0.200797 0.78 13－2 0.233743 0.234369 7－1 0.230410 0.223348 1.56 14－1 0.197985 0.198670 7－2 0.232755 0.233557 14－2 0.197713 0.198398 采用一测多评测得的结果与实际测得结果基本一致，表明建立的方法：相对校正因子准确，方法可行。

制剂中蒽醌类物质的含量测定（案例3） 研究背景 遇到的问题： 处方中的大黄含有大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚，大黄酸等蒽醌类物质，化学结构相似 拟采用一测多评的方法进行蒽醌类物质的含量测定 遇到的问题： 不同分析仪器会造成相对保留时间的差异 缺乏合理的内参物同时指认目标色谱峰 以大黄素为内参物，采用不同仪器所得芦荟大黄素和大黄酸的相对保留时间偏差较大（大于15％） 化合物 相对保留时间（以大黄素为参照） 仪器A 仪器B 芦荟大黄素 0.60 0.71 大黄酸 0.68 0.80 大黄素 1.00 大黄酚 1.18 1.16 大黄素甲醚 1.26 1.22

相关系数达到了预期的效果 解决方案：分别选择合理的内参物 芦荟大黄素以大黄酸为内参物 大黄酚、大黄酸和大黄素甲醚以大黄素为内参物 相对保留时间 芦荟大黄素以大黄酸为参照， 其余分别以大黄素为参照 仪器A 仪器B 芦荟大黄素 0.89 大黄酸 1.00 大黄素 大黄酚 1.18 1.16 大黄素甲醚 1.25 1.22 大黄酸 大黄素 相对保留时间 供试品色谱图 相关系数达到了预期的效果

“丹参”中丹参酮类物质的含量测定（案例4） 研究背景 ：收入美国药典的复核 丹参中含有丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I等化合物，结构类似，符合一测多评的要求 以丹参酮IIA作为内参物，测定隐丹参酮、丹参酮I的含量 丹参酮类相同母核 丹参药材供试品溶液色谱图

复核中发现检测波长的带宽也会影响相对校正因子，提醒实验室在进行相对校正因子的考察时应予以考虑波长的带宽！ 发现的问题： 不同品牌色谱柱会引起相对保留时间的改变，甚至出现出峰顺序颠倒 解决方案： 质量标准中明确色谱柱类型 色谱柱A 色谱柱B 因素 隐丹参酮 丹参酮I 实验室A 1.18 1.31 实验室B 1.15 1.23 带宽为16 1.11 1.17 带宽为4 带宽的问题？？、 复核中发现检测波长的带宽也会影响相对校正因子，提醒实验室在进行相对校正因子的考察时应予以考虑波长的带宽！

“一测多评”技术应用中应注意的问题 适用于结构类似的同系物 同系物紫外光谱图相似度高，在相同波长处的吸收度相差小，即校正因子相差小 同系物相对校正因子不会因为流动相的比例微调而发生变化 目标色谱峰定位是关键 全面的考察各种可能影响色谱峰相对保留时间的因素，不同品种可能的影响因素有差异，应在质量标准中分别予以明确规定 需以相对保留时间结合DAD光谱、指纹图谱（特征图谱）等多种方式对待测目标色谱峰进行指认 相对校正因子的确定需要大量的考察 全面的数据考察基于工艺稳定的产品，避免由于不同批次的不稳定带来的系数变化

制剂中应用一测多评技术的主要问题 建议解决方案： 配合指纹图谱或者特征图谱进行色谱峰确认，避免有关问题。 制剂中由于有其他药味的干扰，可能会影响目标色谱峰的分离 调整分离效果时，会出现目标色谱峰相对保留时间发生偏差的现象 相邻色谱峰在定位时会引起混淆 提取物图谱——干扰峰少 制剂图谱——可能存在相邻色谱峰的干扰 建议解决方案： 配合指纹图谱或者特征图谱进行色谱峰确认，避免有关问题。

整体质量控制的展望 传统鉴别 基于单一指标成分的质量标准 基于有效性和安全性的 整体质量控制 性状、 显微、 理化鉴别 主观性强、 缺乏专属性 引入薄层、液相、气相等现代分析技术定性、定量 采用质谱等技术，研究阐明物质基础，确定有效成分 指标单一，与内在质量关联性仍欠缺 指纹图谱、一测多评等多个有效成分质控 性状、显微 评估确定安全性检测指标 系统专业的安全性检测 基源确证

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