第六章 感染微生态.

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第六章 感染微生态

感染微生态定义 用微生态学的理论和方法研究感染的发生、发展、结局,以及引导感染向宿主健康方向转化的微生态学分支学科。

微生态失调和感染的基础研究和防治 ——已成为21世纪的重大课题 怎么办?! 抗生素滥用导致感染病谱发生重大改变 传统“杀菌”→破坏肠道微生态→耐药菌形成 →内源性感染 怎么办?!

感染微生态学-抗感染新策略 感染性疾病死亡在世界人口死因中占1/3 多种感染性疾病常伴有肠道微生态的严重失调 细菌感染已成为肝病患者死亡的首要原因 肝移植后感染是造成患者死亡的重要原因 医院获得性肺炎(HAP)在我国为第1位医院感染

感染微生态研究面临的主要问题-1 大部分肠道微生物很难体外培养,肠道微生态的菌群种类难以得到准确鉴定 全基因组扩增技术 高通量DNA测序 发现新的微生物,进行鉴别和诊断 肠道微生态感染基因组学研究和数据库建设意义重大!

感染微生态研究面临的主要问题-2 无菌动物在国外商品化程度高,在微生态学研究中应用广泛,国内总体上缺乏该方面的工作 成功培育了无菌大鼠并应用于微生态学 利用实验用小型猪开展肠道感染微生态学研究

国家重点基础研究发展计划: “肠道微生态与感染的基础研究” 肠道微生态失衡与肝病、肝移植感染关系及干预研究 肠道微生态失衡与免疫功能低下者感染发生、发展的研究 肠道微生态失衡对宿主免疫系统影响的基础研究 肠道微生态失衡与感染发生动物实验的研究 肠道微生态结构多样性分析和功能基因、筛选 肠道微生态感染基因组学研究和数据库建设 微生态调节剂防治感染的基础研究

一、感染与免疫的概念 二、动物对原籍菌群的免疫 三、内源性感染的流行环节 四、原籍菌群在抗感染中效应 五、生物兽药在抗感染中应用 六、感染微生态的用途

感染的概念(Infecfion) 传染病学中,感染指病原微生物侵入动物体,在体内定居、生长、繁殖,并引起一系列病理反应的过程称为感染。 微生态学中,感染指在一定条件下动物体内原籍菌群或固有菌群发生易位、易主或数量增减,动物体从微生态平衡转化为微生态失调的过程称为感染。

免疫的概念 免疫是动物体识别自己和非已物质并排除非已大分子物质,从而介导机体内外环境平衡的生理反应。 抗原 抗体 抗感染免疫

抗 原 与动物机体接触后,能刺激机体产生特异免疫应答的异体或异种物质被称为抗原。 大部分的非自身蛋白质都是良好的抗原。 如病毒和细菌的各种特殊结构都是由多种性质不同的蛋白质构成的,是良好的抗原。 大部分的细菌毒素也是抗原。 每种抗原的结构不同,所以有其特异性 异嗜抗原

异嗜抗原 与种属特异性无关,存在于人、动物、植物、微生物等中的相同的抗原,叫异嗜性抗原。 大肠杆菌O14细胞壁脂多糖与人的结膜、粘膜有相同的抗原性。 布氏杆菌与结肠耶尔新氏杆菌有共同的抗原。

抗 体 B淋巴细胞受抗原刺激致敏后,转化为浆细胞,合成各种针对抗原的免疫球蛋白,称为抗体。 抗 体 B淋巴细胞受抗原刺激致敏后,转化为浆细胞,合成各种针对抗原的免疫球蛋白,称为抗体。 免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分为五大类:IgG、IgA、IgM、lgD、IgE,它们是构成体液免疫的基础。

分泌型IgA (sIgA) 在唾液、泪液、初乳、胆汁等各种粘膜细胞的分泌液、尿液中存在的IgA与血清中IgA不同,是由一个蛋白短片段联结成的双体IgA ,称为分泌型IgA (sIgA)。 组成: IgA双体、分泌片 含量:sIgA较血清中IgA高6-8倍,而且能抵抗蛋白酶的水解作用。 作用:是机体粘膜防御感染的重要因素。 分泌型IgA的分泌片是由粘膜上皮细胞合成的,而在唾液、泪液、初乳、上呼吸道分泌物、胃肠液、尿及汗液内的IgA双体(dimer)是由粘膜下浆细胞合成的。分泌片的作用可帮助IgA透过腺体的粘膜表面和抵抗蛋白酶水解作用。胃肠粘膜如果合成IgA或其分泌片的能力出现障碍,就会引起菌群失调。

抗体的特异性 针对每种抗原产生的抗体或致敏淋巴细胞有很高的特异性,只能识别相应的抗原,并与之发生反应。 如大肠杆菌粘附因子刺激动物肠道细胞产生的抗体只能与该粘附因子结合,使该大肠杆菌不能对动物粘附和致病。 但该抗体对其它细菌及同一细菌的其它部位均无作用,甚至对一种粘附因子产生的抗体对另一种粘附因子也无作用。

抗感染免疫 动物机体与病原微生物的相互作用,形成了抵抗微生物的入侵、定居和繁殖的这些反应称抗感染免疫。 根据获得免疫的时间分类: 先天性免疫 获得性免疫 根据特异性分类: 非特异性免疫:动物对病原微生物的无特殊针对性的抵抗力称为非特异性免疫。 特异性免疫:针对特异微生物的免疫称特异性免疫。

免疫耐受 动物对某一抗原物质不产生免疫应答的状态称为免疫耐受。此时,动物对其他抗原仍可发生正常的免疫应答。 先天性免疫耐受:细胞系选择学说 后天性免疫耐受:抑制T细胞作用

细胞系选择学说 胚胎早期发育过程中,免疫细胞分化成针对各种不同抗原的细胞系。 在胚胎期接触某一抗原后,与这些抗原相应的细胞系被破坏或抑制,成为禁忌细胞系,因而对这些抗原不再产生免疫反应。

动物对原籍菌群的免疫 1、原籍菌群不易引起宿主产生抗体 2、宿主低反应性 3、自然抗体

1.原籍菌群不易引起 宿主产生抗体 如将类杆菌经口或非经口接种于分离出该菌的动物,不会诱生抗体,即使诱生了抗体,其滴度也远远低于外籍菌群诱生的抗体水平。 原籍菌群与宿主组织具有相同的或相似的抗原性 sIGA的保护作用 先天性免疫耐受 糖须的保护作用 这是用单联的悉生动物证明的。这就是说,原籍菌不能诱生与其抗原起反应的抗体。

原籍菌群与宿主组织具有相同 或相似的抗原性 原籍菌群与宿主组织具有相同 或相似的抗原性 异嗜抗原的存在 大肠杆菌O14在外膜上有与结肠组织相同的抗原性 类杆菌与小鼠结肠组织有共同抗原,不能引起其原籍小鼠产生抗体 大肠杆菌O86含有血型B物质 肺炎球菌14型含血型A物质 溶血性链球菌的细胞膜与肾小球基底膜及心肌组织有共同抗原 现在可以认为原籍菌不易引起宿主反应,与其抗原性和其宿主组织抗原性有相似性和相同性有关。免疫活性细胞将某些原籍菌视作“自己”,而不是“非己”,特别是由原籍动物的原籍生境分离的微生物更是如此。螺旋体是一个典型的大鼠肠道内的原籍菌,它可存在于上皮组织细胞中的杯状细胞内,甚至盲肠基底膜的巨噬细胞内,它既不危害大鼠健康,也不引起免疫反应。类杆菌可以侵入健康小鼠肠系膜淋巴结、上皮细胞内,吸引目噬细胞和其它参入基底膜免疫反应的细胞内。因此,原籍菌免疫作用机制,可能与普通动物的肠道基底膜与肠系膜淋巴结的高水平的细胞结构有关。这个区域,在无菌动物是萎缩的。

SIgA的保护作用 sIgA在粘膜表面与原籍菌群混在一起,保护原籍菌群,而且能抑制外籍菌。 如干扰霍乱弧菌对肠上皮细胞的接触。 sIgA分子落入肠腔形成粪抗体,对外籍菌和肠道致病菌(伤寒、痢疾及霍乱)产生抑制作用。 sIgA保护原籍菌、抑制外籍菌的原理还不清楚。但sIgA的产生,与正常微生物的存在有联系,无菌动物的sIgA水平低。

先天性免疫耐受 细胞系选择学说 原籍菌即使抗原性与宿主不同,并且也侵入粘膜上皮内,如果在出生后早期就大量定植了,不会引起宿主产生抗体。 如由大鼠分离的乳杆菌可以引起单联的成年悉生大鼠产生凝集抗体,但却不能引起其后代幼鼠产生抗体。原因:成鼠以其为“异己”,而该成鼠的后代却将其视为“自己”。

糖须或糖被(glycocalyx) 大部分细菌的细胞壁与宿主细胞膜不直接接触,它们之间有几十微微米的距离,其间充满来源于细菌的细胞壁和宿主上皮细胞的纤丝状物。细菌和细胞通过这些丝状物保持着密切的接触。这些丝状物从细胞伸向细胞的周围,似将细菌包围起来,故称糖须或糖被(如图6-1箭头所示) 。 糖须同时存在于细菌和宿主细胞表面,是细胞膜表面延伸出来的一种多聚体,包括蛋白质、腊质、多糖、葡萄糖、醛酸、唾液酸等,带有强烈的阴性电荷。 这些丝状物长5~8nm,宽3~5nm。

糖须的作用 包裹细菌的抗原物质,不会刺激动物体产生抗体。 糖须有利于细菌粘附到细胞表面,并在糖须的保护下发展各自的种群,形成微群落,避免不同细菌间过度的混杂和竞争。

图6-1 鸡肠道细菌丝状物与肠绒毛的结合(张日俊,1998)

正常细菌 一些正常的细菌甚至可长期寄居在宿主的组织和细胞内而不对宿主产生有害作用。 厌氧棒状杆菌可寄居在健康人的骨髓及血液内而不致病,与宿主保持着一种和谐的状态。 螺旋体也是一种固有菌,可存在于健康大鼠肠道粘附上皮的杯状细胞中,甚至能在肠粘膜基底层的巨噬细胞中找到,既不对宿主产生明显的有害影响,又不被宿主的巨噬细胞吞噬和抗体所中和。

正常病毒群 并非所有的病毒均对宿主有致病作用。更多的病毒属于正常病毒群。 许多病毒的致病作用是在一定条件下发生的。 在宿主体内长期存在,但对宿主非但无害,而且具有促进生长发育、细胞成熟和提高免疫机能的作用。 许多病毒的致病作用是在一定条件下发生的。 这些病毒可以从宿主细胞自然释放出来,也可以人工诱导出来,在这种情况下,病毒和宿主间的平衡就被打破,病毒就可能对宿主致病。 现已证实,并非所有的病毒均对宿主有致病作用。可以肯定,更多的病毒属于正常病毒群。

2.宿主低反应性 原籍菌群一般不引起宿主产生抗体,即使产生也是低水平。 如双歧杆菌一般不会引起机体产生抗体,尽管数量很大。

3.自然抗体 在人与动物的血清及其它分泌物中可以检测到针对原籍菌群的低水平抗体,称为自然抗体。 在正常人血清内有嗜碱性韦荣球菌和多形态梭杆菌(口腔正常微生物群)的杀菌素。 在正常人血清、唾液和尿内有针对唾液链球菌、肠球菌及大肠杆菌等的低水平抗体。 在健康人体内存在针对厌氧菌的低水平抗体,如类杆菌和梭杆菌,而且这些菌的脂多糖能与该抗体起反应。

自然抗体产生的原因: (1)食物、饮水、空气中抗原的刺激 (2)原籍菌转为外籍菌 (3)原籍菌与外籍菌有相似的抗原 以上论述,基本上支持Dubos(1965)提出的原籍菌群不会引起宿主产生抗体的假说。

食物、饮水、空气中抗原刺激 食物中有一定抗原物质 食物中有血型物质,包括细菌来源的血型物质可使无菌鸡的血液中出现同种血凝素 刚刚出生的无菌小鼠血清球蛋白水平很低,但吃非无菌食物后,抗体水平迅速增加,因此证明:血液中的抗体是食物中抗原刺激产生。 食物中有血型物质,包括细菌来源的血型物质可使无菌鸡的血液中出现同种血凝素 人如果吃了含大肠杆菌的血型活性抗原时,其同种血型抗体迅速增加。 食物中的外籍菌,作为抗原刺激抗体产生。即自然抗体是由交叉免疫反应所致。

原籍菌转为外籍菌 原籍菌如果转移到其它生境,变为外籍菌,可以引起感染,从而引起宿主产生抗体。 原籍菌与外籍菌是生态学上的分类,不是生物学分类,因而实际上很难确定作为抗原的细菌是哪一类。 用无特定病原(SPF)小鼠实验证明,在出生后7-10天,用原籍菌群不能产生抗体。但转为外籍菌就可能产生抗体。 如果以从某一动物某一生境分离的原籍菌免疫原籍动物产生了抗体,才是可信的。实际上很难做到这一点。

原籍菌与外籍菌有相似的抗原 肠道中一些外籍菌与原籍菌有相似的抗原,针对外籍菌产生的抗体亦会与原籍菌反应。 即异嗜抗原

三、内源性感染的流行环节 外源性感染或传染病有三个流行环节:传染源、传播途径和易感畜群。 内源性感染与自身感染也有三个环节:贮菌库、易位途径和易感生境。 前三个环节是病原体在动物群中个体间传播的过程,后三个环节是原因菌在同一宿主体内不同微生境间的易位过程。

(一)贮菌库(reservoir) 或贮菌动物 贮菌库:在微生态学中是引起感染的原因菌的贮存场所或主要来源。 在动物体内有几个主要的贮菌库,如口腔、呼吸道、消化道、泌尿生殖道、皮肤等。 这些贮菌库分别向其生境释放原因菌,如引起呼吸道感染、消化道疾病、尿路感染、腹腔感染的原因菌都可能来自于就近的微生境和微群落。

(二)易位途径 使原因菌由贮菌库易位到易感生境所经过的道路称易位途径。 血行、淋巴道 外伤、手术、插管及其它诊疗措施

(三)易感生境 指受某种损伤的器官与组织。正常的器官与组织一般很难被感染。 局部缺血,外伤或机械刺激等都能提高病原菌的定植能力。 宿主的全身状态如营养不良,免疫功能低下、抗生素应用、射线照射等都可提高生境的敏感性。

四、原籍菌群在抗感染中效应 有的细菌经常能从宿主体内分离到,而且数量较多,被称为固有菌群或原籍菌群。反之,不能经常从动物和人体分离出来,称为过路菌或外籍菌。 生物拮抗 定植抗力: vanderWaaij自20世纪70年代提出“定植抗力”理论。

生物拮抗概念 一个处于生态平衡的正常微生物群,对包括致病菌在内的外袭菌具有明显的抵抗力,这种作用称为生物拮抗作用。 在肠道菌群正常时,给小鼠口服肠炎沙门氏菌,无发病和死亡小鼠;如先口服链霉素与红霉素则动物全部死亡。 链霉素与红霉素联合,对正常微生物群扰乱严重,因而其生物拮抗作用也大为下降。

生物拮抗作用产生的原因 一、厌氧菌的作用 二、抗生素与细菌素的作用 三、免疫与生物拮抗相结合作用 四、生物物理与生物化学条件

一、厌氧菌的作用 厌氧菌,特别是专性厌氧菌,在人畜肠道及其它生境占绝对优势。 专性厌氧菌有强烈的生物拮抗作用。 专性厌氧菌生物拮抗作用机制有以下方面:

1.有机酸的作用 专性厌氧菌在代谢过程中可产生挥发性脂肪酸和乳酸,降低生境内的PH与Eh,从而抑制外籍菌的生长与繁殖; 此外,还可因为肠内容物变酸,促进肠蠕动。在外籍菌尚未在粘膜表面接触、粘附与定植之前就被排出体外。

2.占位性保护作用 专性厌氧菌占正常微生物群的绝大多数,而且与粘膜上皮细胞紧密结合,形成一层生物膜。这层膜起到了对宿主细胞占位性保护作用。 如果这层膜遭到抗生素或辐射破坏,或厌氧环境破坏,专性厌氧菌不能生存,就会遭到外籍菌的侵入。

3.营养争夺 专性厌氧菌数量大,在营养争夺上处于优势。 由于在厌氧条件下厌氧菌的生长速度超过兼性厌氧菌,因而在营养有限情况下,专性厌氧菌将取胜,而兼性厌氧菌在竞争中处于劣势。

二、抗生素与细菌素的作用 抗生素是种间斗争的重要手段。 细菌素是种内斗争的手段,对生境内种属接近的外籍菌可以起到控制作用。 植物根际有许多放线菌,可以产生多种抗生素,从而抑制土壤中对植物有致病性的微生物生长,达到其保护植物宿主的作用。 细菌素是种内斗争的手段,对生境内种属接近的外籍菌可以起到控制作用。 Nisin, reuterisin

三、免疫与生物拮抗相结合 正常微生物群与宿主的免疫配合可以产生强大的生物拮抗作用。 如Freter(1974)霍乱弧菌感染试验。将无菌小鼠分为3组,第1组接种菌苗,第2组接种拮抗菌,第3组既接种菌苗,也接种拮抗菌。结果:1、2组霍乱弧菌虽有减少,但不明显,最明显的是第3组,即免疫与拮抗菌相配合,其生物桔抗作用最强。

四、生物物理与生物化学条件 一个微生态平衡的环境中:正常微生物群与生境构成一个特殊的生物物理与生物化学环境。 该环境对外籍菌不利,外籍菌必须适应这些环境因素才能定植。

五、生物兽药在抗感染中应用 1973 年,芬兰科学家Nurmi等给1日龄雏鸡口服无沙门氏菌成年健康鸡的肠内容物或厌氧培养物,有效地提高雏鸡对沙门氏菌的抵抗力。这一理论及方法称之为Nurmi概念或生物拮抗。 用于排斥病原微生物的天然菌群或其培养物,称之为竞争排斥(生物拮抗)培养物(Competitive Exclusion culture),简称CE。 研究结果表明这两种培养物均能有效地提高雏鸡对沙门氏菌的抵抗力。

根据CE培养物中所含的细菌种类是否已知,分为: 菌种已知的特定培养物 菌种未知的未定培养物

示 例 Baba等(1991)用大肠杆菌、乳酸杆菌以及两者的混合物分别处理悉生动物,然后口服鼠伤寒沙门氏菌,结果均能抵抗鼠伤寒沙门氏菌的感染,混合物表现出更高的抑菌效果。 CE培养物对弯曲杆菌、大肠杆菌有抑制和消除作用。

示 例 Hejlicek等用CE培养物处理1日龄雏鸡 3日后其盲肠中的挥发性脂肪酸,尤其是丙酸的浓度比对照组高几倍,接近成年鸡的水平; 示 例 Hejlicek等用CE培养物处理1日龄雏鸡 3日后其盲肠中的挥发性脂肪酸,尤其是丙酸的浓度比对照组高几倍,接近成年鸡的水平; 大剂量沙门氏菌口服感染3日龄雏鸡,6天后对照组沙门氏菌阳性率100%,处理组为30%。

何明清等(1980)从健康猪场分离的产大肠菌素的大肠杆菌SY-30,对产肠毒素的大肠杆菌O8有明显的生物拮抗。 取SY-30菌株制成活菌制剂,在初生仔猪未吃初乳前,每头口服3-5ml,观察2周,结果试验组保护率81.2%,对照组保护率18.8%。 在其它8个猪场采取同样方法获得相同的结果。 证明未吃初乳的仔猪,肠内处于无菌状态时接种正常菌群,先在肠道定植,对后入侵的致病性大肠杆菌有明显的生物拮抗作用。

蜡样芽孢杆菌SA38菌株制成生物兽药(调痢生或8501)对多种幼龄动物的下痢均有显著疗效。

黄引贤(1996)等从正常猪子宫中分离到乳酸杆菌和粪链球菌,发现这些细菌在体内外拮抗大肠杆菌、葡萄球菌、嗜水气单胞菌、变形杆菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等多种病原菌。 这些菌株研制成--宫康素,在临床上用于防治母畜生殖道感染取得较好的效果。

感染微生态学用途 感染微生态学的出现,使人们从微生态学的角度重新审视感染的发生、发展及转归过程,改变更新了抗感染策略,提出由纯粹“杀菌”转向“杀菌” 同时需“促菌”的感染微生态治疗新观念。