ROS介导的以Nrf2为核心的抗氧化防御体系对肺纤维化调控机制研究 翟华立 2013-9-13

肺纤维化是一种慢性炎症间质性疾病。当纤维母细胞受到化学性或物理性伤害时，会分泌胶原蛋白进行肺间质组织的修补，机体反复修补以致过度，进而造成肺脏纤维化。 肺纤维化的病理特征是肺泡上皮细胞的损伤和成纤维细胞的增殖，胞外基质过度沉积，导致进展性肺功能下降。

肺纤维化的过程 第一阶段，肺组织的炎性损伤。肺脏受到损伤或其他有害刺激，引发炎症和免疫反应。 第二阶段，组织结构破坏。细胞结构和表型的改变，产生大量细胞外基质( ECM) 。同时胞内的促分裂素原活化蛋白激酶( MAPK) 和核转录因子( NF-κB) 通路被激活，促进产生大量的细胞因子。 第三阶段，组织修复。损伤因素持续存在，造成反复损伤。成纤维细胞继续被激活，产生更多的ECM。细胞因子持续不断的引起组织炎症和胶原过度表达，ECM 不断沉积，肺纤维化逐渐形成，最终特发部位肺功能丧失。

肺纤维化的病因、病理特点 已明确病因：吸入SiO2、石棉、氯气、甲苯等有毒有害物质；受到放射性损伤；病毒、细菌、真菌等的感染；博来霉素、磺胺、青霉胺等药物的应用。 肺纤维化病因 病因未明。病因未明的肺纤维化包括特发性肺间质纤维化、结节病、脱屑性间质性肺炎、淋巴细胞性间质性肺炎、伴发于胶原-血管性疾病的慢性间质性疾病。

病理特点 对于病因明确的肺纤维化，致病因素激活炎症和免疫细胞，引起炎症和免疫反应，而且有些致病因素本身对上皮的内皮细胞有直接损伤作用。 对于病因未明的肺纤维化，炎症只起次要作用，肺的改变是由于间质细胞异常增殖或下呼吸道异常的细胞外基质（ECM）沉积所致。

SARS SARS病毒电镜照片 SARS病毒模式图 当SARS病毒侵入肺部后，肺部免疫系统被激活，开始时炎症反应剧烈，损伤肺部，随后机体修补这些损伤。但是大量的病毒造成肺部持续炎症损伤，机体反复修补以致过度，造成肺组织纤维化。

肺纤维化的细胞机制 （1）肺泡巨噬细胞 合成和释放大量具有多种活性的细胞因子、前炎性介质、趋化因子及蛋白酶类等，如转化生长因子(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL-1、6、8)、干扰素(IFN-α、β、γ)、成纤维细胞生长因子(FGF)、集落刺激因子(CSF)、趋化因子(AMGF、MCP-1、MIP-1α)等。

肺纤维化的细胞机制 (2) 肺泡上皮细胞

肺纤维化的细胞机制 (3) 肺间质细胞 粘附分子(ICAM-1)又称CD54,是免疫球蛋白超家族粘附分子之一，是炎性细胞表面整合素的配体。 成纤维细胞是肺间质中一种主要的细胞类型，不仅在ECM和结缔组织成分的产生和转换中起积极作用，而且也调节其他细胞类型尤其是肺泡Ⅱ型细胞和炎症细胞的功能。

肺纤维化与胶原代谢 ECM成分在组织内过度沉积可导致肺纤维化； 基质金属蛋白酶(MMPs)几乎能降解ECM的所有成分 基质金属蛋白酶试剂(TIMPs)能与MMPs结合成复合物抑制其活性，进而引起ECM的合成与降解失衡。 TIMPs在两个阶段参与纤维化过程： (1)在早期损伤阶段和纤维化启动阶段。 组织损伤 MMPs分泌增加，活性增加 基底膜及ECM 溶解破坏 炎性细胞聚集 减少 促进 释放细胞因子 TIMPs的合成与活化

(2)在继发性的组织异常修复阶段。 此阶段初期MMPs可能仍然处于较高水平，之后随着肺组织炎症反应逐渐减弱等多种因素的影响，MMPs活性逐渐降低而且MMps可能多来自基质细胞而非早期的炎症细胞。 用巨噬细胞依赖的IgA免疫复合物诱导的小鼠模型进行研究，发现肺损害可能被TIMP-2抑制。这一实验不仅提示巨噬细胞可能是肺损伤早期MMPs的主要来源，也提示TIMP在肺损伤疾病早期有抗损伤的作用。但是，在疾病晚期TIMPs抑制MMPs对ECM降解，具有促纤维化的作用。

肺纤维化与氧化应激 氧化应激是指机体对外界或内部的各种氧化作用刺激所产生的非特异性的应答。持续暴露在较高的氧分压环境中，容易遭受氧化应激反应。 IPF患者的血清中脂质过氧化产物增加，表明患者存在系统性的氧化应激，而且疾病活动期与其氧化产物浓度增高成正相关。 IPF患者支气管上皮衬液(ELF)中还原型谷胱甘肽(GSH)抗氧化防御不足，这表明氧化-抗氧化的失衡是肺纤维化患者组织氧化损伤的真正原因。

氧化-抗氧化失衡可能通过以下几种途径导致肺纤维化： (1)下呼吸道炎症细胞的氧化应激产物对蛋白质、脂质和DNA的直接氧化作用干扰细胞组织的完整性，通过改变功能性蛋白介导前蛋白水解环境。 (2)氧化剂可增加脂质介质的产生，加重炎症反应。 (3)氧化应激影响结构和炎症细胞的凋亡，改变细胞因子微环境平衡。氧化应激可通过破坏胞内氧化还原状态的平衡，或者激活对氧化还原敏感的效应分子通路，如转录因子、血管转换酶，增加血管紧张素原转换为血管紧张素Ⅱ。血管紧张素Ⅱ被视作氧化应激的介质可诱导凋亡。

(4)氧化剂通过干预细胞信号转导途径，导致前炎性核转录因子如NF-κB、活化蛋白AP-1的激活，促使细胞合成并释放大量炎性介质，如TGF-β、PDGF和IGF-1，这些炎症介质可以激活或刺激成纤维细胞产生胶原纤维。成纤维细胞的激活、分化、增殖和凋亡都与氧化-抗氧化平衡有关。 (5)当吸入的或炎症细胞产生的氧化物增多时，还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)会降低，也会影响多种细胞氧化还原信号过程，从而导致与炎症和纤维化相关的一些基因上调。

活性氧与肺纤维化 活性氧(ROS),如O-2、H2O2、·OH等，高浓度时都会对机体产生毒性并损伤细胞成分。产生氧自由基的细胞有嗜中性多形核粒细胞(PMN)、肺巨噬细胞(PAM)、肺血管内皮细胞(EC)。EC的黄嘌呤氧化酶(XOD)起着启动和原发作用，而PMN则起着继发和扩大氧自由基的作用。

ROS通过氧化还原修饰或硝化修饰靶分子活性中心的巯基或血红素铁来转导信号，以GSSG与GSH相对含量为标志的细胞氧化还原状态参与了ROS的信号转导。 正常情况下，由于上皮细胞的抗氧化作用，活性氧刺激可触发上皮细胞凋亡，避免坏死性死亡引起的前炎症反应和炎症反应。但过多的活性氧存在，使氧化能力超过了上皮细胞的抗氧化能力，导致细胞坏死性死亡，引起严重的炎症反应，最终形成纤维化。

肺部的抗氧化防御 肺细胞具有很强的增殖与组织修复功能，同时肺细胞中丰富的代谢酶系统也可通过代谢活动消除肺毒物及其产生的具有损伤作用的活性代谢物，从而表现出肺对外源性化学物的适应与耐受。 肺不仅可以通过结合、转移等作用消除体内外来化学物或其代谢物外，还可以通过其自身所具备的抗氧化酶和抗氧化物质消除肺毒物在肺中所产生的活性氧，阻止肺细胞脂质过氧化的发生，进而达到防御外来化学物对肺损伤的目的。

氧、二氧化氮或百草枯 刺激 肺 降低 增加 磷酸戊糖旁路代谢 H2O2水平 减少 生成 NADPH、GSH 活性自由基的形成 减少 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 谷胱甘肽-S-转移酶 降低 增加 磷酸戊糖旁路代谢 H2O2水平 减少 生成 NADPH、GSH 活性自由基的形成 减少 过氧化物的积聚

内源性细胞抗氧化防御体系是由多种蛋白与小分子组成的，它能够维持机体的“还原”环境。经典的抗氧化物酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)，可以使ROS失活，阻止ROS启动的反应。 SOD2基因敲除小鼠与正常小鼠相比，更易发生高氧所致的肺损伤。通过外源性补充SOD1或CAT可以减少肺损伤。

Nrf2与抗氧化调控 Nrf2(Nuclear factor-erythroid 2 related factor)是一种调控制造红血球核因子2相关因子的转录因子，在氧化应激应答中起核心作用。 Nrf2由p45和p18两个亚基组成，p45是 CNC转录因子，Nrf2需形成CNC-Maf异二聚体的情形下才能启动转录。 Nrf2作为一种以亮氨酸拉链结构为主的转录调节因子，与ROS和亲电试剂反应，可诱导由ARE/E pRE调节的抗氧化酶的基因表达。

PF中氧化应激相关的调节机制

CAPE的作用机制 咖啡酸苯乙酯(CAPE)是一种天然的黄酮类化合物。 CAPE的作用机制：①CAPE主要机制为抗氧化和抗中性粒细胞作用；②预防性使用CAPE可有效阻止再灌注时自由基的释放和保护与协同抗氧化酶的活性。

CAPE在10μM就能完全阻断中性粒细胞诱导的活性氧化物质的产生，阻断黄嘌呤氧化酶系统。经研究发现，CAPE是蜂胶中抗氧化作用的重要组分。 CAPE对BLM诱导的肺纤维化有显著的抑制作用，CAPE可以提高纤维化模型动物肺组织SOD与CAT的活性，减少硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和NO的量，研究认为CAPE的治疗作用主要由于其自由基清除能力和抗炎活性。用CAPE处理后的大鼠肾上皮细胞会增强Nrf2的核转位与ARE的结合。

Conclusion 肺纤维化不单是炎症反应，后期的氧化-抗氧化平衡起着重要的作用； 肺上皮细胞损伤造成成纤维细胞的增殖，产生胶原蛋白，促进纤维化的发展； MMPs/TIMPs的比例决定着ECM的变化，从而进一步影响肺纤维化的发展； 氧化应激对PF的发生发展占有重要地位，一方面是活性氧的直接损伤作用，另一方面Nrf2介导的抗氧化防御体系异常会影响活性氧的信号调节； ROS介导的以Nrf2为核心的抗氧化酶的改变是肺纤维化中氧化-抗氧化失衡的一个重要原因；

活性氧(ROS)可以通过调节Nrf2介导的抗氧化酶的改变影响肺成为纤维细胞的状态与功能； CAPE可以调控Nrf2与抗氧化酶 ，控制胞内关键 的信号分子H2O2的浓度，改善BLM与H2O2对成纤维细胞的刺激作用，从而实现对肺成纤维细胞状 态的调节，它对Nrf2的活化机制可能与其结构有关 。CAPE对肺纤维化动物模型有一定的治疗效 果。