基因诊断 第一节 概述 一、 什么是基因诊断 所谓基因诊断，就是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。 是以DNA和RNA为诊断材料，利用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法和过程；其临床意义在于能检测DNA或RNA的结构变动与否，量的多少及表达情况等，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊或进行基因治疗的依据。

二、基因诊断的概念界定以下6个方面内容： （一）诊断水平 基因水平 （二）诊断技术 从方法学来说，没有特殊的基因诊断方法，就是分子生物学技术在临床上的应用。 （三）诊断材料 DNA和RNA 。 （四）诊断内容 1、对于内源性基因来说：基因结构和表达是否异常。 2、对于外源性基因来说：入侵基因的种类，是病毒核酸、细菌质粒还是寄生虫DNA. （五）诊断途径 1、直接检查基因结构是否存在：DNA点突变、缺失插入、基因重排、染色体畸变、mRNA剪接缺失错位或结构变化等。 2、检查基因转录产物mRNA： 1）已经转录还是没有转录？ 2） 应该转录还是不应该转录？ 3） 转录正常、过量还是过少？ 3、 检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。 （六） 诊断目的 1、  确诊相应疾病或得出相应结论。 2、  是防治疾病或基因治疗的根据。

三、基因诊断的思路 （一）基因是随便能诊断的吗？总不能乱诊断吧？ （二）基因诊断和传统的疾病诊断方法有什么区别 和联系？ （三）基因诊断的理论基础和技术 能不能诊断 诊断学基础 怎样诊断？ 为此，作下述讨论。希望对大家有所帮助。

四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法 表1 表型诊断（传统方法） 基因诊断 （一）诊断依据 疾病表型变化 基因结构异常和表达异常 （二）分 类 临床诊断（病因、病解、病生） DNA诊断 血清学诊断 RNA诊断 生化学诊断 （三）特异性 表型改变在很多情况下是非特 以探测基因为目标，只要 异性的，往往难以明确诊断， 有特异性探针，利用分子 延误病情如FOU? 杂交原理即可 诊断，具有 很高的特异性。  （四）敏感性 探针可用“放标”或“非放 诊断灵敏度高，标本只需 微量，DNApg水平即可。 （五）早期诊断 因为表型改变往往出现较晚， 在表型改变之前，基因 难以早期诊断 结构或表达已发生改变， 故往往可以早期诊断。  

（六）基因诊断范围广 因为：①探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未知，目标可为特定基因或 特定基因组合，外源性或内源性基因，所以适应性强，诊断范围广。 ②被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤（如CML）疗效及预后尤为重要。 ③在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体，能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性E.coli）和不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩大了实验室诊断范围。

（七）二者关系 1. 基因诊断必须建立在临床一般检查的基础上，它必须是临床检查的第二步或第三步手段。（不是随便诊断） 2. 基因诊断是分子生物学和医学遗传学发展到今天人们的一种设想，现在逐步走向临床，变成现实。 3. 尽管实验研究和临床应用技术原理相同，但诊断对象是人的时候应该慎重！（不能乱诊断） 4. 同临床诊断一样，忌不独立思考，人云亦云（举例）。

基因诊断与表型诊断 性状 基因 蛋白质 基因诊断 生化诊断 临床诊断

（五）基因诊断与诊断学 （一）诊断是用医学科学的方法对疾病的表现所作出的辩证逻辑的结论。诊断目的：为了防御疾病和进健康。 （二）诊断学是论述诊断疾病的基本原则和方法的一门课程。其基本原则就是研究症状体征发生的基本规律和机理以及建立诊断的思维程序。基本诊断方法包括：询问病史、体检、实验室检查、以及其他检查如：心电图、超声检查、内窥镜、CT、核磁共振等等。 （三）基因诊断是诊断学的续写，是诊断学的新篇章，从这个意义上来说： 基因诊断遵循诊断学的基本原则； 基因诊断的基础是医学基础，专业基础是医学分子生物学和医学遗传学，不同的是我们在基因水平上，学习和研究：基因解剖（结构）、基因生理（转录翻译等）、基因病解（结构异常），基因病生（表达异常），然后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。

（六）基因诊断的思维程序： 第一套：逆向遗传学（reverse genetics） 思维程序 1. 提取人类基因组（总）DNA； 2.建立DNA文库（DNA BANK）； 3.克隆任一DNA 片段作为探针。 4.确立该探针在基因组中的位置；这种探针在基因组中的位置一旦被确定下来，就可以成为遗传标记（genetic marker）. 5.大量应用此类新的遗传标记(用染色体步移法或染色体跳跃法)建立各条染色体的连锁基因图谱，最终建立整个人类的基因图谱。 6.筛选遗传病病人或疑有与基因有关的疾病的病人； 7.克隆病变基因8.比较正常基因和异常基因的差别推测正常异常基因产物（蛋白质）在细胞中定位以及生理病理效应。

第二套 拿来主义 1.您诊断/研究的疾病是否：与/有/知道 2. 据1设计基因诊断方案。 1）基因有关； 2）该基因的正常/异常序列； 第二套 拿来主义 1.您诊断/研究的疾病是否：与/有/知道 1）基因有关； 2）该基因的正常/异常序列； 3）该基因结构/表达异常的类型； 4）特异性探针/PCR引物； 5）转录物； 6）表达产物/表达产物功能/表达产物功能测定方法。 2. 据1设计基因诊断方案。

第二节 基因诊断的分子生物学基础 一、基因诊断的理论 （一）生物大分子结构和功能 （二）基因组结构和功能 （三）遗传信息的复制和表达 （四）基因表达的调控 （五）细胞通讯与细胞信号转导的分子机制 （六）癌基与抑癌基因 （七）基因与疾病

二、 基因诊断的技术 （一）核酸分子杂交， 在这些方法中， 1.Southern印迹法 是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。 2.Northern印迹法 可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。 3.斑点杂交 可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。 4.原位杂交 可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。

(二）聚合酶链式反应（PCR） PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析，单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析，DNA序列测定等联合应用。 （三）单链构象多态性 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为PCR—SSCP技术。

（四）限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。 （五）DNA序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位的突变的性质。 （六）DNA芯片技术 应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。

三、基因诊断的内容 （一）基因结构异常（基因突变检测） １、点突变 1）已知的点突变 （三）连锁分析 2）未知的突变 1、限制性片段长度 　　　１、点突变 1）已知的点突变 2）未知的突变 2、少数核首酸的缺失或插入 3、大片段丢失或插入 4、基因重排（染色体易位） 5、基因扩增 （二）基因表达异常（基因转录物探测） 1、mRNA相对定量 2、mRNA绝对定量 3、mRNA长度分析 （三）连锁分析 1、限制性片段长度 2、性家系连锁分析 3、连锁不平衡 （四）病原体的诊断 入侵基因的种类

四、基因诊断的途径 （一）内源性基因诊断的途径主要有3种： 即：基因突变的检测 mRNA的探测 连锁分析 采取哪一条途径主要取决于： 对致病基因及其分子病理学的了解程度； 致病基因本身突变类型的复杂性。

1.入侵基因组DNA具有特异的DNA序列，以区别于别种生物体DNA序列。 （二）外源基因的入侵的病原体的诊断 1.入侵基因组DNA具有特异的DNA序列，以区别于别种生物体DNA序列。 2.能把这种特异的DNA序列制成具有特定信号的探针。 五、基因诊断的基本方法 （一）点突变 1、已知点突变 PCR/ASO探针斑点（或缺缝）杂交法 （1）据突变（位点序列：）a.设计一对引物，b.合成一对寡核苷酸探针（正常/突变序列杂合子） （2）提取患者基因组（总）DNA→PCR扩增（突变序列） DNA片段→（与ASO）斑点（或狭缝）杂交 洗脱条件：完全配对（牢）不洗脱； 不完全配对（不牢）易洗脱。

（3）结果分析： 　　　①与正常探针杂交，而不和突变探针杂交表示受检者不存在这种基因； 　　　②只与突变探针杂交，说明突变基因是纯合子； 　　　③与正常/突变， 探针都可杂交， 说明突变基因是杂合子； 　　　④与正常/突变探针都不杂交说明不是已发现的突变。 2、未知点突度 SSCP—PAGE法、测序法 　提取DNA→DNA变性→SSCP—PAGE→ 测序确证 （二）少数较苷酸缺失或插入的诊断方法可以用（一）的方法

（三）大片段丢失 多次多重失PCR电泳分析 设计引物使获得产物序列长短不同，有固定大小，据不同长短序列存在与否，检测是否有某些基因片段的缺失与突变（注意正常对照）。 引物1 引物3 致病基因 5′ 3′ 引物4 引物2 （四）基因重排（染色体易位） 多次/重PCR电泳分析、其前提是已知重排基因和重排位点的序列。 引物1 引物3 5′ 3′  （五）基因扩增 　限制酶酶切待测基因的DNA或CDNA片段作为探针（位置改变）法光密度扫描（定量）。 基因扩增→拷贝数增加（分子量）→电泳行为改变→杂交条带位置改变→与标准/正常对照定性/量扫描。

（六）多态性分析 1、RFLP 　（１）基本方法：①PCR产物酶切产物电泳分析。②基因连锁分析（PCR/RFLP连锁分析法）。 人群个体核苷酸序列的差异性、称为DNA的多态性。由此影响限制酶切部位点而致RFLP（限制性片段长度多态性）。RFLP按照孟德尔方式遗传。故： ①可检测人群中个体间存在的RFLP（限制酶酶谱分析） ②遗传病的基因诊断（连锁分析）。如果一特定家庭（系）中，某一致病基因与特异性的多态性片段紧密连锁（连锁—是指同一条染色体上相邻近的基因一起被被遗传），就可以用这种多态性片段作为“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿基因组中是否携带有致病基因。对于某一限制酶来说：酶切位点在人群中存在共性（可能一样对核酶谱来说存在多态性（不一样）。 （２） DNA多态性位点普遍存在整个人类基因组，估计每100个核苷酸便有一个发生突变，出现多态性。如果建立起一套以20CM间隔平均分布于整个基因的RFLP位点，选用合适的探针，理论上可以对所有的遗传病进行基因诊断。

（3）关于基因连锁分析 ①多数遗传病诊断途径， 因为：经基因突变检测途径，适用病种有限，原因是： a、致病的基因可在任何位点上产生突变，致使同一疾病有不同的突变类型。 b、不少致病基因仅仅知道在哪一号染色体位置，尚未克隆出来，对其结构和分子机制毫无能知。 c、有的致病基因尚未确定。 ②基因连锁分析必须具备的先决条件： a、家系中的关键成员（父母）为RFLP的杂合子，才能区分两条同源染色体。连锁遗传病只要母亲为某一RFLP的杂合子即可。 b、子代存在患病的纯合子，这样才能确定致病基因与哪条染色体RFLP共同遗传。 c、任何一种遗传病、单独使用一种RFLP、均有相当一部分父母染色体无法区分、所以要联用若干种RFLP及相当探针，提交诊断。 d、待检亲代必须为生物学意义亲代。

③连锁不平衡并不多见： 指某一个多态性位点在基因和等位突变基因中的分布频率有显着差异。因此可用与特异等位基因连锁这一多态性进行基因诊断。如： 正常人酶切图谱有9/9、22/9、22/22kb型，β-地贫纯合子只有9/9kb型（kan发现撕工岛人β-珠蛋白基因3’BamHI的多态性位点）故不经家系分析，仅以这一多态性即可用产前诊断。 ④RFLP连锁分析可能常是可靠的。连锁分析存在一定的错误原因是： a、人为差错。b、RFSP连锁分析方法本身的差错程度（方法本身局限性。） 因为在减数分裂中间传染色体的某些区域可以发生重组和交换，从而使得原先共同遗传的DNA突变与RFLP发生分离，这样情况下作出连锁分析结果就会发生错误。诊断的错误率可以从DNA标志与疾病的共同遗传度来估计，重组率高于5%的连锁探针不宜采用，事实表明，除个别情况外，由于染色体重组所致的错误诊断小于1%，因此，RFLP连锁分析通常是可靠的。

2、微小重复序列（如CA序列）多态性分析。 （１）基本方法： PCR/PAGE家系分析法（教材P146）。 　①重复单位和重复次数不同具有高度的遗传多态性，对他们和等位基因进行家系分析，说明他们遵照孟德尔遗传规律、是一套新的 遗传标记系统 　（２）应用举例： 产前基因诊断杜氏肌营养不良（突变类型未明）。

（七）基因表达异常的诊断。 　　1、mRNA相对定量 　　（1）点杂交（或狭缝杂交）光密度扫描法； 　　（2）RT—PCR； 　　2、mRNA绝对定量 RT—PCR/竞争性PCR 　　3、mRNA长度分析 Northern杂交法，RT—PCR产物电泳分析 （八）病原体的诊断 PCR法

第三节 基因诊断的应用 一、 遗传病的基因诊断 （一）血红蛋白病 血红蛋白病是由于血红蛋白合成异常所致的遗传性血液病。习惯上分为异常血红蛋白病和地中海贫血２类。 1.异常血红蛋白病是 　　珠蛋白肽链结构的改变变导致主要功能部位氨基酸的置换，影响Hb的溶解度、稳定性及生物学功能。分子基础：单碱基替代，缺失、插入…… ２. 地中海贫血（α地中海贫血和β地中海贫血） 是珠蛋白合成速率降低，导致链和非链合成的不平衡→多余的珠蛋白链沉积在Rbc膜上→改变了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。

4.诊断要求 Hb Punjab α地中海贫血（ α珠蛋白合成↓） β地中海贫血（ β珠蛋白合成↓ ） 占我国新疆异常Hb病55.6% （1）产前诊断为主要目的。 每一民族或群体有特突变类型谱中国人主要突变类型有6种（P30） 分子基础 Hbβ链121密码单个碱基替代：GAA（Glu) →CAA（Gln） →改变了EccRI一个识别位点 大多数是α珠蛋白基因缺失所致。 点突变、缺失或插入往往不涉及限制酶识别位点。 DNA诊断： PCR扩增（ β珠蛋白第3个外显子和基因3´端DNA序列、全长144bp）EcoRI酶切电泳分析。 （3）液体分子杂交C1限制酶谱分析，或PCR扩增电泳分析 PCR/ASO探针法（主要方法） 结果 正常对照40/104bp两个片段HbPuN Job 144bp,40/104bp两种类型杂合子（同理扩增β珠蛋白DNA片段Mnl I酶谱分析诊断HbE（ β26 Glu→Lys)) 正常对照有正常杂交信号（C1）酶切片段不缺（C2）PCR产物有（C3）α地贫与正常结果反之。 PCR/RFLP连锁分析法 RNA诊断： 异常Hb病人mRNA的RT/PCR产物测序知编码区碱基变化—推导相应氨基酸变化。 RT-PCR介导的α珠蛋白mRNA定量↓。 ①PCR介导的mRNA定量法。 ②mRNA的剪切缺陷检测（自学）

（二）杜氏肌营养不良症（DMD）和贝克营养不良症（BMD） 2. 主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。 　　DMD多在5岁发病，在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的1/3500。 BMD症状较DMD为轻，寿命较长，并有生育能力，发病率为1/30000。 3. 分子基础： 抗肌萎缩蛋白基因内（1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。 （2）部分重复（病例的5%） （3）缺失或重复的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范围内。

4.DMD、DNA诊断 因DMD（及BMD）大多数为基因缺失所致，该病DNA诊断主要是抗肌萎蛋白基因缺失的检测。诊断技术： （1）基因组探针法 用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来接进行相应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。 （2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、外显子拼接改变和基因内部分重复。 （3）多重PCR法 如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的DMD患者。 （4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析或CA多态性分析适用于非缺失型DMD。 5.DMD、RNA诊断： 诊断技术 RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。 联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。

1、苯尿症是一种常见的隐性患传性氨基酸代谢病。 2、主要特征：（1）苯丙氨酸 酪氨酸→多巴→儿茶酚胺 苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （三）苯酮尿症（PKU） 1、苯尿症是一种常见的隐性患传性氨基酸代谢病。 2、主要特征：（1）苯丙氨酸 酪氨酸→多巴→儿茶酚胺 苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生不可 逆大脑损害和严重智力发育障碍。 3、分子基础：（1）迄今约3/4的导致中国人经典型重PKU的突基因已被查清 ，它们分属11种基因PAH基因点突变。体外研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。 （2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val）→GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶识别位点，故又称“序列多态性”。②这一“序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性， 故可作为一种“遗传标记”应用于产前诊断。 苯丙氨酸 羟化酶↓ （肝、PAH）

4、DNA诊断：①PCR/ASO探针法。若待诊断的PKU家系的基因突变类型尚属“未知”或无RFLP信息。②PCR/SSCP—直接则序法→不定期出导PKU的点突变。 5、序列多态性连锁分析 前提是该家系存在述第399密码子序列多态性 用于产前诊断： （不知基因实变类型，也无RFLP信息。） 病案—某孕妇曾生育一例PKU患者，现妊娠第二胎8周，要求对胎儿进行产前诊断。 诊断：（1）PAH基因的RFLP分析：该家庭除ECORI外，其它酶切点都不具有杂合性，而丈夫、患儿、孕妇、胎儿双均为ECORI11/17kb片段的杂合子，因此胎儿可能正常，可能为PKU患者。据RFLP分析无法对胎儿作出产前诊断（为什么？缺乏基因连锁分析先决条件。 （2）序列多态性：PCR/ASO探针DNA片段点杂交法。①PCR扩增父亲、孕妇/患儿、胎儿PAH基因片段。②合成ASO（相应于第399密码子中性实变序列的一对等位基因的特异ASO探针。③杂交： 说明： ①患儿扩增DNA片段与正常/中性突变ASO探针杂交; ②父亲;③胎儿扩增a、患儿的1个PKU，基因与密码子399A→T中性突变相偶（连锁），这个PKU基因来自母方。 a.孕妇。 b、胎儿没有这一中性实变，可以排除胎儿为PKLL患者，结合ECLRI位点RFLP资料，可产和的诊断胎儿完全正常。c、胎儿出生后基因分析和随方证实诊断正确。 DNA片段中能与正常的ASO探针杂交。

四、血友病 是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因子。重型血友病甲和乙的男性发病率为1/5000~1/50000。为甲型血友病和乙型血友病。 主要特征： ①也是X连锁遗传的凝血缺陷疾病。 ②约1%左右乙型血友病人FIX基因缺失（因而在用替代疗法过程中会产生FIX的抑制物）。 ③在非缺失（FIX基因）型中，已发现398种不同的基因突变。 （FIX基因定位在Xq26→q27，全长34kb包括8个外显子）。 ①是一组X连锁遗传凝血缺陷疾病。 ②缺乏Xq远端的FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。 ③基因突变具极为异质性，与β地贫不同。（因子占X染色体全长0,1%，共186kb包括26个外显子）不存在存族和群体特异性，几乎每一种不同的甲型血友病家系都具有自已独特的突变类型。（所以该病基因诊断不宜用PCR/ASO探针直接检测点突变，而主要依赖RFLP连锁分析）

4、诊断情况（报道）： ①应用克隆化FⅧcDNA与VIII基因连锁DNA片段和DX18、St14等分析了基因或旁侧的限制酶酶切位点多态性，并采用PCR/BCLI或XbaI RFLP连锁分析法进行了甲型血友病的产前诊断和携带者检测。 ②用PCR/SSCP法检查了FVIII内含子18处BCL I的多态性。 （终止妊娠对胎儿作凝血子测定和DNA分析、证实产前诊断正确。） ①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，鉴定了FIX基因的5个限制者多态性位点，故可用RFLP连锁分析进行产前诊断和携带者检测。 ②病倒：乙型血友家系分析FIX基因发现某患者缺失该基因5kbDNA序列（第2~3外显子+第2内含子全部+部分第1，第3内含子） a、对该家系一例乙型血友病变高危妊娠产前基因诊断，诊断胎儿为男性乙型血友病患者。 b、对该孕妇第二胎产前诊断为女性乙型血友病基因携带者。 （上海医遗传所淅江乙型血友病家系）

二、传染病的基因诊断 类 别 基因特征 诊断方法 1、病毒性肝炎 ①甲型肝炎（HAV） ①甲肝病毒基因是线状分子、约含于7500个核苷酸。 类 别 基因特征 诊断方法 1、病毒性肝炎 ①甲型肝炎（HAV） ①甲肝病毒基因是线状分子、约含于7500个核苷酸。 ②已获HAV几个毒株cDNA克隆。 ①CDNA探针杂交（RNA）法。②SSRNA探针杂交（RNA）法有报道。 ②乙型肝炎（HBV） ①HBVDNA约3.3kb，是非共价闭合的环状结构。 ①PCR斑点杂交法。 ②PCR电泳EB染色法 ③丁型肝炎（HDV ①HDV基因为环状SSRNA长约1678个核苷酸 ①DNA或cDNA探针杂交（RNA）法 ②RT/PCR单抗ELISA法 2、细菌引起的疾病（1）产毒性Ecoli、侵袭性Ecoli;(2) 霍乱弧菌；（3）痢蒺杆菌；（4）淋球菌基因诊断用PCR扩增斑点杂交法。 3、疟疾、寄生虫基因诊断用PCR或结合探针技术。

三、肿瘤的基因诊断 （一）基因重排的生理和病理 基因重排—指某些基因片段改变原来存在的顺序，通过调整有关基因片段的连接顺序，再重排为一个完整的转录单位 1.生理 （1）基因表达DNA水平的调控方式之一。 （2）免疫球蛋白分子多样性的分子机理之一。 2.病理 重排和重组位点之间DNA片段移除，会使在恒定区两侧的某些限制酶切位点的位置发生改变。可用： （1）限制性片段长度改变； （2）分子杂交（恒定区域连接区基因为探针）。 确定基因重排的存在与否，以对肿瘤进行基因诊断。

（二）基因内部重排与B细胞淋巴瘤 J k 入 1 2 1 2 1 2 免疫球蛋白重链基因探针（J）和轻链基因探针（k，入）对B细胞 淋巴瘤DNA的杂交图谱。 说明： 1、正常对照 2、B细胞淋巴瘤， 入基因无重排 ，重排后杂交端的位置 实验： 提取瘤细胞DNA→酶切（至少2组以上）杂交（至少两种以上）→结论（看到2组以上的杂交图谱改变时，即可下诊断结论）。

（三）基因间重排（染色体易位） 淋巴样肿瘤细胞的染色体易位 癌基因 肿 瘤 染色体易位 发生频率 C-myc …… …… …… …… …… …… …… bc1-2 囊性淋巴瘤 t（14;18)( q32;qI1) 85% …… …… …… …… 两个重要事实： 1、囊性淋巴瘤染色体易位频率最高； 2、所有易位都涉及到C-onc的易位。 这对于诊断，分型和预后具有重要的意义。

（四）基因重排与CML的诊断 1.图：22号染色体和9号染色体易位导致慢性粒细胞白血病（CML）易位结果22号染色体长臂丢失，形成微小的ph（费城首次发现的）染色体。（CML中90—95%的病例具有ph染色体）。 9 22 9q+ 22q-

2.说明： 1.ph染色体是染色体易位t（9;22） 2.C-onc C-ab 和c-sis分别位于第9号和第22号染色体长臂上，易位涉及到两个癌基因的互换（基因间重排，但通常不涉及它们的基因内部重排，故一般认为重排后它们的基因结构并无改变）。 3.CML DNA分子中最具有结构特点并可以用于诊断的序列区域是bcr，研究发现，第9号染色体断裂点位置变化很大，多半出现在c-abl5’端100kb区间内；第22号染色体断裂点较集中，基本上存在于一个5.8kb区域内。这个区域叫断裂点簇区即bcr。 4.CML发生染色体易位时，先在各自的断裂点处断开，然后进行基因间重排，使c-abl/bcr形成融合基因，此基因可转录和翻译自己特异的mRNA和蛋白质。 5.为了准确测定bcr重排，须： ①选择适当的探针； ②选择两个以上的限制酶酶解产物作杂交分析。 ③CML具有bcr重排（多数）和bcr未重排型（少数） ④Bcr重排等同ph阳性； ⑤Bcr重排与CML缓解期复发有正性关系，与预后有关系，与ALL，AML有关系。 PCR技术检测bcr/abl转录产物也可用作CML的诊断，预后和判断治疗效果等用途。

（五）肿瘤异质性的分子基础：基因表达图谱分析用于肿瘤分类分期 （六）基因扩增与乳腺癌的预后 （七）原位杂交技术在肿瘤病理诊断中的应用（自学）。四、基因诊断方法在法医学上的应用 （一）DNA指纹（基因指纹） 概念——在人体基因组DNA中存在高度可变的小卫星区域，在同一酶解物的Sou-thern印迹图上同一个体的不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，这种southern印迹图被称为DNA指纹。

1.Jeffreys据珠蛋白基因座近处出现的RFLP频率及测定的核苷酸总数，推算出人基因的异质性是非常大的，约100bp中就有一个差异，但并不完全均一，有的顺序（核心序列）比较稳定，有的区域变动很大（超变区）它们都是一些很短的重复顺序。 2.对这些重复顺序酶切时，可产生16，17、32、33、3F、4、62和3F6bp长度不等的限制性片段。 3.人工合成很短的重复序列作为探针，与酶切的人体DNA作southernblot，可得出长度不等的杂交带，杂交带的数目和分子大小，几乎不可能有两个人是完全相同的，因此，把这种杂交图形称为DNA指纹，它是基因特异诊断有力的根据。 4.DNA指纹按孟德尔方式遗传。 （二）DNA指纹分析在法医学的应用于个体识别和亲子鉴定。