Electrogenerated Chemiluminescence (ECL) 化学发光与电致化学发光 Chemiluminescence (CL) & Electrogenerated Chemiluminescence (ECL) 崔 华 中国科技大学化学系化学发光实验室

化学发光 一、化学发光现象

萤火虫发光

生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是，直到十九世纪末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。 1877年 洛粉碱CL 1905年 洛粉碱类似物 1928年 鲁米诺 1935年 光泽精 1960s PMT 出现 发现许多有机反应可产生CL

所谓化学发光 (CL) , 就是化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态激发到激发态从而产生发光的现象。 化学发光反应能级图

二、化学发光反应的分类 直接化学发光 A + B  C* + D C*  C + h 例: NO + O3  NO2* + O2 NO2*  NO2 + h

间接化学反应发光 A + B —> C* + D C* + E —> E* + C E* —> E + h 例:

三、化学发光反应发生的条件 化学反应是放热反应。 化学反应的自由能的变化与发光波长的关系: –G  hc / ex  2.857 × 10 – 4 千卡 / ex 摩尔 400~750nm的可见光发射时所需要的G 的数值应在38~71千卡之间。 必须存在形成电子激发态的通道。 激发态分子必须以辐射光子的形式回到基态, 或将能量传递给荧光分子。

四、化学发光反应的机理 激发态氧生成型 H2O2 + Cl22 HCl + O2* O2*  O2 + h 低浓度 单分子发射 1268 nm 高浓度 双分子发射 634 nm 分子对同时跃迁

最有效的化学发光反应与双氧基化合物的分解有关。 双氧基化合物分解 最有效的化学发光反应与双氧基化合物的分解有关。 基态＋h

电子转移反应 + + e- 中性分子 自由基阴离子 氧化剂 受激分子 还原了的氧化剂 自由基阴离子与氧化剂之间的电子转移

自由基阳离子与还原剂之间的电子转移 h

五、化学发光反应 无机物的化学发光 一些无机物能够产生很弱的化学发光，例如： 硫酸氢盐被铬酸氧化 水被K、Na、Mg汞齐分解 Al被空气中氧氧化 强酸被强碱中和 亚硫酸钠被空气氧化

有机物的化学发光 烃 醇、醛、酮、酸、酯 多酚 杂环化合物

典型的化学发光反应 鲁米诺 (luminol) * + max = 425 nm OXIDANT BASE luminol * 3-Aminophthalate + h 3-APA max = 425 nm 氧化剂: H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 [Fe(CN)6]3-. 催化剂: 过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(Co2+、 Cu2+、Fe3+) 抑制剂

光泽精 (lucigenin) max = 440 nm(绿色) 氧化剂: H2O2 还原剂 + O2 还原剂: 乳酸 尿酸 抗坏血酸 还原剂: 乳酸 尿酸 抗坏血酸 催化剂: 过渡金属离子 抑制剂: 酚类物质对此反应有抑制作用

过氧化草酸酯 (peroxyoxalates) 氧化剂: H2O2 此反应本身能产生弱的化学发光 max = 440 nm, 550nm.

邻菲罗林 (1,10-phenanthroline) 氧化剂: H2O2 催化剂: Cu2+ Co2+ Pb2+ Fe3+ Ni2+ 抑制剂: 蛋白质与Cu2+形成络合物

吖啶酯 The molecular structure of the used acridinium ester NHS Mechanism of Acridinium Salt Chemiluminescence with hydrogen peroxide Org. Lett. (2003) 21:3779–3782

1,2-二氧杂环丁烷类 Alkaline phosphatase (ALP) dephosphorylates AMPPD (1,2-二氧杂环丁烷类） to form a dioxetane anion, which fragments into adamantanone （金刚烷酮）and the excited state of methyl meta-oxybenzoate anion （间氧苯甲酸甲酯阴离子）, the light emitter. The detect limit of ALP is 10-21mol/L. The derivatives of AMPPD are superior than the parent compound to the lighting rates and signal intensities.

此反应重要的分析对象是ATP 10-11~10-14mol 萤火虫发光 (firefly BL) max = 562 nm 此反应重要的分析对象是ATP 10-11~10-14mol

此反应常用于NADH和NADPH试验 10-15mol 细菌发光 (bacterial BL) max = 490nm 还原型吡啶核苷酸黄素 主要分析物 FMN 10-12mol 此反应常用于NADH和NADPH试验 10-15mol

六、化学发光的表征 动力学曲线（反应时间） 光谱 量子产率 化学发光强度

h 七、化学发光分析  — dcA dt k[R][A] k CA(t) 使[R]过量 CA(t) = CA0 e-kt Ic L(t) = cl  = cl kCA(t) = cl k  CA0 e-k  t 尽管A物质的 CA0 各不相同, 但 I 达到 Imax的时间相同. e-k’t为常数. Icl(t) CA0 定量分析的依据

利用发光反应动力学曲线对催化物质的分析

八、化学发光的探测 分立式进样化学发光仪 PMT 这类仪器适合于选择性好, 量子效率高或发光体寿命长的化学发光反应的监测。 R1 PMT R2 s 这类仪器适合于选择性好, 量子效率高或发光体寿命长的化学发光反应的监测。 不适用于快速化学发光反应(<15S)的重现性监测。

流动注射进样化学发光仪 流通池(flow cell) 样品sample PMT recorder waste 蠕动泵

九、化学发光分析的特点 优点: 灵敏度高, 线形范围宽； 仪器简单, 价格便宜； 分析时间短。 缺点: 选择性差。

电致化学发光 一、电致化学发光现象 电致化学发光 (ECL) 是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。

二、典型的电致化学发光反应. 多环芳烃的ECL 按激发态分子或离子产生的历程可分为两类: 通过单重激发态途径的ECL(S-route ECL) R - e → R.+ 电极氧化 R + e → R. - 电极还原 R. + + R. - → R + 1R* 自由基湮灭 1R* → R + h ν 发光过程 9,10-二苯基蒽,将200Hz 左右的方波电位(1.3 -2.2V vs. SCE)加到电极 DPA - e → DPA. + 1.3 V DPA + e → DPA. - -2.2 V DPA. + + DPA. - → 1DPA* + DPA 1DPA* → DPA + h ν ( λ = 512nm)

通过三重态途径的ECL (T-route ECL) R + e → R. - 电极还原 R. + + R. - → 3R* + R 自由基湮灭 3R* + 3R* → 1R* + R 激发态转化 1R* → R + h ν 发光过程 N,N,N’,N’-四甲基苯二胺(简称TMPD)和DPA 的混合溶液中, TMPD – e → TMPD. + 0.16 V DPA + e → DPA. - -2.1 V DPA. - + TMPD. + → 3DPA* + TMPD 3DPA* + 3DPA* → 1DPA* + DPA 1DPA* → DPA + h ν

on a rotating ring (Au)-disc electrode (Au) system 鲁米诺的ECL on a rotating ring (Au)-disc electrode (Au) system disc: OOH negative pulse ring: OOH  O2  positive pulse LH   L 

鲁米诺的典型ECL 反应机理

Ru(bpy)3 2+ - e → Ru(bpy)33+ 电极氧化 Ru(bpy)32+的ECL Ru(bpy)32+ + e → Ru(bpy)3+ 电极还原 Ru(bpy)3 2+ - e → Ru(bpy)33+ 电极氧化 Ru(bpy)3+ + Ru(bpy)33+ → Ru(bpy)32+ + Ru(bpy)32+* Ru(bpy)32+* → Ru(bpy)32+ + h  ( λ = 620 nm)

当体系中含有强氧化或还原性物质,只要施加单向正或负电压就可以得到Ru(bpy)32+ 的ECL。如典型的Ru(bpy)32+ - C2O42- 和Ru(bpy)32+ - S2O82- 体系： Ru(bpy)32+ - C2O42- 共存体系的ECL 机理

Ru(bpy)32+ - S2O82- 体系的发光反应机理: Ru(bpy)32+ + e → Ru(bpy)3+ S2O82- + e → SO42- + SO4.- SO4.- + Ru(bpy)3+ → Ru(bpy)32+* + SO42- SO4.- + Ru(bpy)32+ → Ru(bpy)33+ + SO42- Ru(bpy)3+ + Ru(bpy)33+ → Ru(bpy)32+ + Ru(bpy)32+* Ru(bpy)32+* → Ru(bpy)32+ + h

吖啶酯的ECL Possible ECL mechanism of AE in alkaline aqueous in the presence of TPA Anal. Bioanal. Chem. (2011) 399:3451–3458

三、电致化学发光仪 PRECL仪器结构图 自制的电化学发光池和组合电极示意图

四、 电致化学发光的特点 灵敏度高,线性范围宽, 仪器简单。 化学发光反应的电化学诱发可对这些反应在时间上进 行控制。 化学发光反应的电化学诱发可对这些反应在时间上进 行控制。 可通过变换电位控制反应, 改善选择性。 光产生于电极附近, 改善了分析探测的空间控制。 不稳定试剂可现场产生。 没有电化学探测中的电子干扰问题。 一些化合物可在ECL反应中被循环使用。 电极表面的污染问题。 ECL体系较少, 分析物种有限。 机理问题。

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