新型卵巢癌标记物HE4 的研究进展 崔 恒 北京大学人民医院 妇科肿瘤中心

世界范围统计资料 癌 新发 死亡 宫颈 470,000 230,000 卵巢 190,000 114,000 内膜 188,000 45,000

美国2008

卵巢癌的现状 一个难题：无成熟的早期诊断方法； 二个70%：确诊时约70%已属晚期；治疗后即使是已达到临床完全缓解的病人仍有70%最终将复发； 三个进展：手术病理分期、肿瘤细胞减灭术、紫杉醇+卡铂化疗方案 四个焦点：保留生育/生理功能、早期的辅助治疗、晚期的治疗、复发的诊断和治疗

卵巢癌的诊断策略-- 早期诊断 卵巢癌的早期诊断一直是卵巢癌研究中最具挑战性的课题 肿瘤诊断的三大支柱 图像诊断：B超 CT、MRI PET/CT 血液与体液检测：肿瘤标记物 细胞学与组织学诊断

现阶段卵巢癌的诊断 目前常用的诊断方法包括：1）妇科三合诊；2）阴式彩色B超；3）血清CA125的检测；4）计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET或PET/CT）等

关于诊断正在研究中的有： 放射免疫显像（RII） 新的或多种血清标记物的检测 血清中卵巢癌特异抗体的检测 恶性肿瘤危险指数评分（RMI) 癌基因和抗癌基因突变的检测，特别是与遗传相关基因的检测（芯片） 发现和寻找新的特异抗原和基因

肿瘤标记物的定义 与肿瘤相关的抗原或某种生物活性物质 肿瘤细胞异常表达 反映癌变发生、发展过程 可被检出

有效的肿瘤标记物 特异性强 敏感性高 交叉反应小 早期诊断率高 随病情变化监测值变化明显

临床应用 肿瘤诊断及鉴别诊断 肿瘤残存 复发的预测及复发部位监测 疗效观察及预后评估 对无症状早期癌及高危人群的筛查

血清肿瘤标志物的检测 CA125是应用最多的卵巢癌血清肿瘤标志物，特别是最常用的监测卵巢癌复发的指标。 Ⅰ期卵巢癌患者仅有约30-50% ＞35u/ml，监测复发的敏感性、特异性、阳性预测值分别为79％、95％、100％。 1％健康妇女、3％良性卵巢肿瘤、6％非卵巢相关的良性疾病可有血清CA125水平升高。在子宫内膜异位症、盆腔结核、炎症等甚至高达50-70%

卵巢癌相关的其它标志物 基因分析和组织化学分析已发现许多新的可能与卵巢癌相关的标志物 MUC1 Kallikreins：hK4, hK6, hK8, hK10 Mesothelin Antileukoproteinase 1 (ALP1) Osteopontin VEGF S100A1 Inhibin LPA B7-H4 HE4，表达上调在卵巢癌中最常见，且在早、晚期患者中mRNA和蛋白的表达均上调。

HE4 HE4 （Human Epididymis Secretory Protein 4,人附睾分泌蛋白4） 1991年由Kirchhoff等从人的附睾中克隆出cDNA，基因定位在染色体 20q12-q13.1，全长为12kb左右，由5个外显子和4个内含子组成，编码的蛋白质与细胞外蛋白酶抑制剂有很高的同源性，是一种酸性蛋白质。 1999年Schummer等发现HE4 mRNA在卵巢癌组织中高表达，而在癌旁组织中 不表达。HE4在恶性肿瘤中的高表达多见于卵巢癌、子宫内膜癌，少见于肺腺癌及间皮瘤。

HE4在早期（I期）的卵巢癌中的敏感性及检测卵巢癌总的敏感性均高于CA125，是卵巢癌敏感及特异的标志物，可用于对卵巢癌的早期诊断及辅助监控卵巢癌患者的治疗情况。 英国的一项研究对200，000妇女用30多种肿瘤标记物分别单独或与CA125联合进行卵巢癌筛查，HE4可以使诊断卵巢癌的敏感度和特异度提高

Biochemistry of HE4 HE4 - Human Epidiymis secretory protein 4 Member of the WAP-gene family of protease inhibitors (new name WFDC-gene family) Characterized by an approx 50 aa sequence with 8 highly conserved cysteine residues that form 4 disulphide bridges. WFDC (Whey Acidic Protein Four Disulphide Core) Tumour associated WFDC-proteins ALP1, Elafin, HE4 (WFDC2), PS20 (WFDC1) Chromosome 20q12- q13.1 contains a locus with several members of the WFDC family. Amplified in several cancers: ovarian, breast, Colon, pancreatic, lung cancer WFDC gene locus

HE4 mRNA expression profile Restricted expression profile in normal tissue Expressed in normal epididymis, and epithelia of the respiratory and reproductive tract Tumor-restricted expression in ovarian cancer > 90 % of serous ovarian cancer HE4 mRNA highly expressed in lung adenocarcinomas > 60 % high expression in AdC < 10 % high expression in SqC Expression of HE4 mRNA in cancer From Galgano et al Modern Pathol (2006)19; 847 - 853

HE4 antigen expression in Ovarian cancer Galgano et al Modern Pathol (2006)19; 847 - 853 Drapkin et al Cancer Res (2005) 65;2162-2169 HE4 antigen is highly expressed in serous, endometroid and clear cell ovarian cancer Mucinous, germ cell or sex cord ovarian cancer barely express HE4

HE4 是一种适宜的卵巢癌血清标志物 正常卵巢不表达，而在卵巢癌高表达--特异性好 HE4的表达独立于CA125的表达 – 联合检测将较各自单独检测获得更 多的信息

HE4诊断试剂盒 HE4 EIA试剂盒由瑞典Fujirebio Diagnostics AB公司生产，已经获得了FDA认证和CE认证，在美国、欧洲等多个国家上市销售，现正在申请在中国上市注册。 Fujirebio Diagnostics AB公司研制的HE4 EIA试剂是国外唯一用于定量检测人血清中HE4的试剂，国内尚无任何检测HE4的试剂上市销售。

主要试剂： 检测原理： HE4 EIA 方法的建立 2H5 and 3D8 MAb established using HE4-Mouse Ig fusion protein as immunogen Hellstrom et al, Cancer Research 63, 3695 – 3700, 2003 检测原理： Two-step forward sandwich immunoassay based on Bio 2H5 MAb for catching of HE4 and HRP 3D8 MAb for detection

HE4 用于监测卵巢癌 Study on 80 patients, 4,4 observations/patient Measured concordance between biomarker change & clinical status Compared HE4 and CA125 约 80%患者HE4与CA125相符，与病情一致

HE4 在卵巢癌的动态监测中与CA125具有良好的互补性 Conclusion: HE4 and CA 125 show equivalent but complementary performance for monitoring of ovarian cancer

HE4 EIA中国注册临床试验总结 瑞典康乃格公司市场部 2009年3月

临床研究方案 样本量及样本量确定的依据 根据国食药监械[2007]240号发布的《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（以下简称“临床导则”），HE4 EIA属于进口三类体外诊断试剂。 临床导则要求临床验证至少要在三家省级以上医院进行实施，总样本数不少于1000人份。

样本选择依据 HE4 EIA试剂属于国内首次申请注册的用于定量检测患者血清中的HE4浓度，可用于上皮性卵巢癌患者的辅助诊断和疗效监测。因此，临床试验收集的血清样本包括： 上皮性卵巢癌样本、盆腔包块疑似样本、正常健康人样本、其他肿瘤样本、良性疾病样本及干扰样本等。同时包括临床收集的跟踪样本。

入选标准：不同样本组收集的血清，要求知道当前受试者的临床诊断。收集的血清样本要求足够用于试剂盒的检测。 样本收集：根据样本要求，医院收集常规的血清样本，要求标记清楚。 样本保存：血清样本在2-8℃条件下可以保存3天，或者 - 40℃下长期保存。 样本运输：血清样本的运输需要在2-8℃条件下进行，样本的使用不能超过限定时间。所有人体来源的样本必须按照国家和国际的运输规章运送。

金标准的确立：临床采用病理检测结果作为卵巢癌诊断的金标准。 质量控制方法： 严格按照产品的说明书要求进行操作，要求质控品C1和C2结果在标示范围内； 严格执行编盲的原则，避免主观判断影响产品的检测结果； 产品检测过程中，为了避免人为试验误差，在产品解盲后，如果研究试剂和金标准结果不一致，要求进行重复测定。

临床研究观察指标 CUT-OFF值 汇总正常健康女性样本的检测结果，给出P95结果作为CUT-OFF值。参考试剂盒提供的CUT-OFF值，对中国健康人群的CUT-OFF值进行评价。 灵敏度、特异性、总符合率、阳性预期值和阴性预期值。 临床疗效监测 将浓度变化和病程发展汇总到 2x2 表格中，分析HE4在疗效跟踪上的有效性。 临床试验中的精密度、重复性的检测。

多中心临床研究 医院 检测样本数 主要研究者 339例 崔恒 344例 张震宇 394例 张晓霞 合计：1077例 第1分中心 第2分中心 第3分中心 394例 张晓霞 合计：1077例

检测样本分布 分组 样本类型 样本数 年龄分布 1 上皮性卵巢癌 96例 25-75岁 2 健康人群 363例 17-82岁 3 其他肿瘤 （肺癌、乳腺癌、肠癌等） 98例 20-80岁 4 疑似样本 （盆腔包块患者） 305例 12-87岁 5 干扰样本（高胆红素、高脂） 110例 13-79岁 6 良性疾病 （高血压、妇科炎症等） 95例 21-82岁 7 交界性肿瘤 10例 25-87岁 合计 1077例

中国人群CUT-OFF值的评价 临床检测正常健康人群样本363例，HE4浓度检测值范围为：22.8-106.0pM 73.7pM：中国健康人组（P95）的参考值。 150pM：试剂盒提供的参考值。

各中心健康人CUT-OFF值的评价 中心分布 CUT-OFF(P95) 中国健康人群 73.7pM 第1分中心 78.3pM 第2分中心 第3分中心 72.6pM 中国健康人群 73.7pM 各分中心评价中国健康人群的CUT-OFF值基本一致，可以选择73.7pM作为中国 正常健康人群的参考范围。

不同的CUT－OFF值 对卵巢恶性肿瘤的诊断能力 73.7pM 91.7％ 84.4％ 85.1％ 36.8％ 99.0％ 150pM 77.1％ 98.1％ 96.3％ 80.4％ 97.7％ 结论： 以73.7 pM作为CUT-OFF值时，可以大大提高对上皮性卵巢癌病人的诊断率，避免漏检。 以150 pM作为CUT-OFF值时，HE4在健康人群及良性疾患等对照组中的具高特异性，能有效的鉴别诊断卵巢良、恶性肿瘤，为临床上皮性卵巢癌的辅助诊断提供有力帮助。

入组患者血清HE4水平分布 说明：在干扰样本中，提示高胆红素可能对HE4的检测有干扰，与国外研究结果 一致。 样本类型 HE4测定值分布（n=1067例） 阳性率（％） 总例数 0-73.7pM 73.7-150pM >150pM CUTOFF=73.7pM CUTOFF=150pM 上皮性卵巢癌 96 8 14 74 91.7％（88/96） 77.1%(74/96) 盆腔良性疾病 305 262 40 3 14.1%(43/305) 0.98%(3/305) 非盆腔良性疾病 95 62 32 1 34.7%(33/95) 1.05%(1/95) 其它肿瘤患者 98 33 36.7%(36/98) 3.1%(3/98) 健康人群 363 345 18 4.95%(18/363) 干扰样本 110 89 10 11 19.1%(21/110) 10%(11/110) 说明：在干扰样本中，提示高胆红素可能对HE4的检测有干扰，与国外研究结果 一致。

HE4在卵巢癌恶性肿瘤中的 动态监测的评价 动态监测HE4浓度变化要求： 为了避免试剂检测中存在的偏差，选择2.5倍的最大精密度(CV)作为HE4浓度变化的指标。HE4的阳性变化（阳转）/阴性变化（阴转）为当前结果比前一测试结果的测定值升高或者降低至少2.5倍最大CV。 动态监测样本： 多中心临床动态监测评价，共收集34例上皮性卵巢癌患者的64份血清。 32例患者同时收集了术前、术后样本。 2例患者动态监测均为术后样本。

HE4浓度变化与病程发展情况统计 临床动态监测符合率: 61/64=95.3%，HE4 可以用于上皮性卵巢 HE4浓度变化 恶化 无恶化 合计 阳转 3 无阳转 61 64 临床动态监测符合率: 61/64=95.3%，HE4 可以用于上皮性卵巢 癌的疗效监测。

32例患者术前/术后HE4浓度变化图 备注：HE4浓度变化值=（手术后HE4浓度-手术前HE4浓度）/手术前HE4浓度×100% -120.00% -100.00% -80.00% -60.00% -40.00% -20.00% 0.00% 20.00% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 卵巢癌患者姓名 HE4浓度变化值（%） 备注：HE4浓度变化值=（手术后HE4浓度-手术前HE4浓度）/手术前HE4浓度×100% 其中1-25号为阴转样本，26-32号为非阴转样本。

HE4 EIA精密度的评价 三家临床医院测定的3份高、中、低临床样本结果分别进行汇总分析 每份样本有30次检测结果，分别计算CV值，CV值均低于15% 符合临床试验方案要求。

HE4在交界性肿瘤的浓度分布 临床试验过程中共检测了10例交界性肿瘤，其中2例HE4浓度分布为150-300pM，3例为73.7-150pM，5例低于73.7pM。

研究结果 当以73.7 pM作为CUT-OFF值时，临床在进行诊断中如果能结合其它的临床诊断方法，可以大大提高对上皮性卵巢癌病人的诊断率，避免漏检，以免贻误患者的治疗。 当以150 pM作为CUT-OFF值时，HE4在健康人群及良性疾患等对照组中的具高特异性，能有效的鉴别诊断卵巢良、恶性肿瘤，为临床上皮性卵巢癌的辅助诊断提供有力帮助。 HE4浓度变化与病情发展间的一致性为95.3% (61/64)，说明HE4 EIA可以用于上皮性卵巢癌的疗效监测。 精密度试验结果提示证明试剂盒性能可靠、方法稳定。

HE4与CA125血清检测比较 （北京大学人民医院） 总例数 HE4(pmol/L) CA125 (ku/L) P 值 中位数(范围) 阳性率 中位数(范围) 阳性率 卵巢恶性肿瘤 30 243.8( 27.3~1306.2) 63.3% 601.4(6.2~797.6) 86.7% 0.03 卵巢良性疾病 卵巢良性肿瘤 45 24.7(8~ 65.7) 0 12.0(2.8~735.5) 8.9% 0.058 子宫内膜异位 57 38.3(6.5~67.3) 0 52.9(8.9~ 644.9) 56.1% 0.000 盆腔炎性疾病 8 26.5(11~ 36.7) 0 41.3(6.3~741.6) 62.5% 0.000 健康人 137 32.4(19.4~107.2) 0 11.1(1.4~28.8) 0 /

Allard 在2008年ASCO会议上报道，对80例上皮性卵巢癌患者经过治疗后监测复发的434个血清样本，分别检测其CA125和HE4，临床用CT影像学来判断肿瘤大小和复发。结果 CA125 或HE4 联合应用与临床一致性较高，为 83.8% (67/80)。 连续动态监测临床符合率： CA125 78.8% (63/80)； HE4 76.2% (61/80). CA125 不符时, HE4符合率 23.5% (4/17).；HE4 不符时 CA125 符合率 31.6% (6/19). 联合 CA125 or HE4 临床符合率 83.8% (67/80).

术前确诊可改善卵巢癌预后 1 out of 5 women will be diagnosed with an adnexal mass during their lifetime1 5 - 10% of women will have surgery for an ovarian neoplasm 13 - 21% of these masses will be malignant 由妇科肿瘤专科医生施行手术将改善卵巢癌的预后 问题是：How do we identify malignant pelvic masses from benign masses?

Improved survival with surgery by ovarian cancer specialists Type of Hospital Impacts Survival rates Type of Surgeon Impacts Survival rates TH: Teaching hospital NTH: Nonteaching hospital C- 45 C- 45 Paulsen et al, Int J Gynecol Ca, 2006: 16; 11-17

ROMA value = expPI / [1 + expPI] x 100 Premenopausal women Predictive Index (PI) = - -12.0 + 2.38*LN[HE4] + 0.0626*LN [CA125] Postmenopausal women 8.09 + 1.04*LN[HE4] + 0.732*LN ROMA value = expPI / [1 + expPI] x 100 Risk of Ovarian Malignancy Algorithm (ROMA) value Estimate of the risk of ovarian cancer given that the patient had a pelvic mass; their HE4 and CA125 values; and their menopausal status 47

Biomarker and ROMA Scatterplot B9 LMP EOC I/II III/IV B9 LMP EOC I/II III/IV HE4 CA125 B9 LMP EOC I/II III/IV ROMA

ROMA Validation trial - Conclusions At a specificity of 75%, the overall sensitivity for EOC+LMP was 89% Overall sensitivity for EOC was 94% Pre-menopausal women 89% Post-menopausal women 95% NPV 94% for EOC+LMP in Pre- and postmenopausal women combined NPV 97% for EOC 17/279 (6%) patients classified as low risk had EOC or LMP 9/17 had LMP tumor 1 (0.4%) had late stage (III/IV) cancer ROMA effectively stratifies patients with pelvic mass into groups with low and high risk of having epithelial ovarian cancer

Risk of Malignancy Index (RMI) RMI = U x M x serum CA 125 level ROMA™ vs RMI Risk of Malignancy Index (RMI) RMI = U x M x serum CA 125 level U = 0 for imaging score of 0 = 1 for imaging score of 1 = 3 for imaging score of 2-5 M = 1 if premenopausal = 3 if postmenopausal Let examine how ROMA performs compared with risk assessment tools currently used in clinical practice. An algorithm that is used either formally or informally by clinicians to assess risk in a patient with a pelvic mass is the Risk of Malignancy Algorithm or RMI developed by Ian Jacobs. The RMI employs an imaging score along with CA125 values and menopausal status to calculate a risk for malignancy. This is an algorithm that employs clinical findings on imaging and uses quantitative data to derive a patients risk for malignancy. We compared ROMA to the RMI which uses clinicopathologic variables to demonstrate that the performance of ROMA as a stand alone test is superior to a currently used clinical algorithm. Jacobs I et al. Br J Obstet Gynecol.1990; 97:992-929. C- 50 50

ROMA™ has increased sensitivity compared with RMI Benign and EOC: All Stages Pre & Post Menopausal Benign (n = 315) vs EOC (n = 124) Sensitivity* (95% CI) Specificity (95% CI) RMI 85% (77% to 90%) 75% (70% to 80%) ROMA™ 94% (89% to 98%) We found at a specificity of 75%, the ROMA had a sensitivity of 94%, compared to the RMI, which achieved a sensitivity of 85%. This difference was found to be statistically significant *Two Sample Test of Equality of Proportions p=0.0129 CI: Confidence Interval 51

ROMA™ Has Increased Sensitivity vs RMI For Early Stage Cancer Benign and EOC: Stage I & II Pre & Post Menopausal Benign (n=315) vs Stage I-II EOC (n=35) Sensitivity* (95% CI) Specificity (95% CI) RMI 66% (48% to 81%) 75% (70% to 80%) ROMA™ 86% (70% to 95%) When we look at early stage I & II invasive EOC patients, the ROMA achieved a sensitivity of 86%, compared with a sensitivity of only 66% for the RMI. This difference approached statistical significance with a p value of 0.05 *Two Sample Test of Equality of Proportions p=0.0510 CI: Confidence Interval 52

表 患者被ROMA划分为高危组和低危组的分布 月经状态 疾病 高危(例 ) 低危(例) 合计(例) 敏感性(%) 特异性(%) PPV (%) NPV (%) 绝经后 恶性 35 2 37 EOC 28 0 28 良性 4 8 12 合计a 32 8 40 100.0 66.7 87.5 100.0 合计b 39 10 49 94.6 66.7 89.7 80.0 绝经前 恶性 12 4 16 EOC 8 0 8 良性 23 103 126 合计a 31 103 134 100.0 81.7 25.8 100.0 合计b 35 107 142 75.0 81.7 22.9 96.3 全部 恶性 47 6 53 EOC 36 0 36 良性 27 111 138 合计a 63 111 174 100.0 80.4 57.1 100.0 合计b 74 117 191 88.7 80.4 63.5 94.9 a：指EOC与良性肿瘤的合计，b：指恶性肿瘤与良性肿瘤的合计

HE4 Clinical Investigations Italy Mestre-Venice – Pelvic mass Milano – Pelvic mass Brescia – Endometrial cancer Roma – Ongoing real life study Norway Oslo – Many biobank studies Sweden Stockholm – Biobank pelvic mass Brasil Sao Paolo – Ovarian cancer Belgium Leuven – Pelvic mass

HE4 Clinical Investigations 血清HE4与CA125联合检测用于鉴别卵巢癌和卵巢子宫内膜异位症 血清HE4 检测用于子宫内膜癌的诊断和随访 血清HE4用于肺癌的诊断

HE4联合CA125 鉴别诊断子宫内膜异位症和卵巢癌 HE4的编码基因WFDC2主要在卵巢子宫内膜样癌、子宫内膜癌中有表达, 并且在正常的子宫内膜腺体中也有表达，但是在子宫内膜异位病灶中是否有表达尚不明确，

我们实验室最检测了57例卵巢子宫内膜异位症患者血浆中HE4和CA125的浓度。数据结果与49例卵巢癌，60例卵巢良性肿物，50例健康对照作对比，初步探讨血清人附睾分泌蛋白4(HE4)和CA125水平检测在鉴别诊断子宫内膜异位症和卵巢癌的价值。

（1）CA125在各组中的中位数 （2）HE4在各组中的中位数

在子宫内膜异位症中 在卵巢癌中 HE4和CA125无相关性 HE4和CA125有相关性 r=0.14 P=0.125 r=0.475 在子宫内膜异位症中 在卵巢癌中 HE4和CA125无相关性 HE4和CA125有相关性

卵巢子宫内膜异位囊肿以正常为参照 卵巢子宫内膜异位囊肿以良性肿物为参照 HE4:ROC-AUC =0.453 HE4:ROC-AUC =0.453 卵巢子宫内膜异位囊肿以正常为参照 卵巢子宫内膜异位囊肿以良性肿物为参照 HE4:ROC-AUC<0.5无诊断意义 HE4:ROC-AUC<0.5无诊断意义

卵巢癌以卵巢子宫内膜异位囊肿为参照 HE4:ROC-AUC=0.933 HE4:ROC-AUC=0.933 CA125:ROC-AUC=0.821 HE4+CA125 :ROC-AUC=0.936 卵巢癌以卵巢子宫内膜异位囊肿为参照 HE4:ROC-AUC=0.933

HE4和CA125联合诊断 CA125可以排除良性卵巢肿物和盆腔子宫内膜异位症，但是不能鉴别卵巢子宫内膜异位囊肿和卵巢癌 HE4对卵巢癌有高度的敏感性，因此可以将卵巢子宫内膜异位囊肿和卵巢癌区分开

相同特异度下的敏感度

因此，HE4联合CA125可作为子宫内膜异位囊肿和卵巢癌的鉴别诊断依据 对超声显示有盆腔包块的患者： HE4和CA125水平同时升高提示卵巢癌可能； CA125升高HE4无明显升高提示卵巢子宫内膜异位可能；

HE4作为卵巢癌、子宫内膜异位症和其他恶性肿瘤的标志物，正在临床发挥越来越重要的作用。随着对HE4基础研究的深入，还有可能在临床产生更加重大的意义。

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