第9章 转基因动物与动物生物反应器 Transgenic Animal ＆ Animal Bioreactor ◆ What 基本原理 ◆ How 技术方法 ◆ Why 技术应用

Nikon Small World 2007 Competition Winners Double transgenic mouse embryo, 18.5 days (17x) It illustrates a late-stage developing mouse embryo with the yolk sac and placenta intact. All of the structures within the embryo have red fluorescence, while the yolk sac exclusively has green fluorescence, showing the details of the body plan. Nikon Small World 2007 Competition Winners

转基因动物 Transgenic Animal

转基因动物的研究历史： 1974年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。 1981年，美国科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。1982年获得转基因小鼠。 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶，含量高达30毫克/升。 1989年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠。 1997年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功。 1997年10月，英国罗斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只携带有人凝血因子Ⅸ基因转染绵羊。 1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。

一、转基因动物的概念（What） 二、转基因动物的培育方法（How） 三、转基因动物的应用（Why） 四、转基因动物研究中面临的问题 五、动物生物反应器

一、转基因动物 Transgenic Animal 定义： 指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合厚随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。 十大神奇转基因动物

◆ What 基本原理 1、制备 2、导入 3、整合 4、检测 借助分子生物学和胚胎工程的技术，将外源目的基因在体外扩增和加工，再导入动物早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物输卵管或子宫中后，发育成携带外源基因的转基因动物。 1、制备 2、导入 3、整合 4、检测 携带了外源基因并能表达和遗传的动物

一、转基因动物的概念（What） 二、转基因动物的培育方法（How） 三、转基因动物的应用（Why） 四、转基因动物研究中面临的问题 五、动物生物反应器

二、技术方法 How

转基因动物制作方法 克隆目的基因 精子载体法 构建载体 雄原核注射法 逆转录病毒载体法 曲细精管注射法 胚胎干细胞法 核移植法 目的基因随机整合入动物个体基因组 目的基因转录、翻译 产生蛋白和表现功能 转基因动物

转基因动物的一般制备过程

转基因动物的一般制备过程（续）

A: 目的基因的制备 目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。 需要克隆的DNA片段 编码某种蛋白质 研究某基因与疾病的关系 研究某基因结构和功能的关系

目的基因的获取 化学合成法 聚合酶链式反应（PCR） 直接从染色体DNA中分离 基因组DNA文库;cDNA文库

1、 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列

目前常用的方法： 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法 自动化合成法。

机械切割法 （1）超声波 （2）高速搅拌 （3）DNA溶液小孔喷射 2、 从染色体中分离目的基因 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。 （2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。 （3）DNA溶液小孔喷射 注射器法可将100kb以上的DNA剪切成10 kb左右的片段。

限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。 酶切

3、聚合酶链反应(PCR) PCR 基因放大连琐反应 染色体 PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大

4、 基因文库、cDNA文库获取目的基因 基因文库（gene library） 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，因此，称之为基因组文库（genomic library）或基因文库（gene library）。

组织或细胞染色体DNA * 从基因组DNA文库获取目的基因 限制性内切酶 基因片断 克隆载体 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌

cDNA文库 cDNA library cDNA (complementary DNA，互补DNA) 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。 cDNA (complementary DNA，互补DNA) 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。

cDNA文库的特点： （1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。

B: 外源基因导入方法 基因

基因显微注射法 制备转基因动物

胚胎干细胞介导法

胚胎干细胞法获得转基因鼠

将重组DNA分子转入包装细胞 反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病毒RNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。

转基因克隆动物 着床前胚胎 分离培养 转染 目的基因克隆，构建载体 胚胎干细胞 卵裂球或内细胞团细胞 ①随机 ②同源重组 筛选 带目的基因阳性克隆扩增 核移植 转基因克隆动物 目的基因功能鉴定

5.酵母人工染色体法 YAC 人工染色体载体 是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件 构建的载体，含 16 条染色体，其 大小为 225-1900kb ， 总计有14×106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。 YAC人工染色体载体最常用的是 pYAC4 。

酵母人工染色体(YAC)能克隆百万对碱基的大片段DNA 技术途径： A. 阳性ES细胞在YAC转染及体外筛选,囊胚腔注射 B. YAC的原核徽注射。 优点： A. 保证大片段DNA的完整性 B. 提高较长外源片段在动物转基因时的整合率 C. 保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应.因此，YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用

转入基因的整合和表达 外源基因进入细胞后的命运 整合到染色体内 随机整合 定点整合（重组） 游离在细胞浆内暂态表达 在核酸酶的作用下降解

C: 外源基因表达的检测 转基因动物中外源基因的检测 染色体及基因水平：斑点杂交、Southern杂交、PCR 转录水平：Northern杂交 蛋白质水平：Western印迹

转基因动物的鉴定（1）

转基因动物的检测与鉴定（2） 活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。 生物发光（Bioluminescence）是化学发光中的一类，特指在生物体内通过化学反应产生的发光现象，主要由酶来催化产生的。如萤火虫产生的。现在我们实验中经常用到的荧光素酶报告基因系统，这些皆为生物发光。

Green Piggies A research team at Taiwan's leading National Taiwan University succeeded in breeding three male green pigs by injecting fluorescent green protein into embryonic pigs.

D：转基因动物纯合体的培育

E：转基因动物纯合体的扩群 常规育种 胚胎切割 体细胞克隆

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三、转基因动物技术的应用

重组人p53腺病毒注射液(今又生Gendicine） 药品介绍：是一种经基因工程重组、具有感染活性的腺病毒颗粒，由载体DNA和基因两部分组成：一是抑癌基因，称之为p53基因。肿瘤是一种基因病，人类50%以上的肿瘤与p53基因的变异有关；第二部分是载体，源于腺病毒DNA，可以有效地将治病的p53基因转入肿瘤细胞内。

基因打靶技术（gene targeting ） 基因打靶技术是利用同源重组的原理，采用分子生物学的方法定向改变生物活体遗传信息的实验手段。在分子生物学层面上，Gene knockout是gene targeting技术的一种。 基因剔除(gene knockout)：定点突变 基因替换(gene knockin)：定向重组 目前这种技术主要在小鼠胚胎干（ES）细胞中进行。

基因剔除小鼠的制作 gene knockout

三种技术的融合 first third second

简要过程

一、 基因打靶的必备条件 （一）ES细胞 取小鼠胚胎早期内细胞团，即小鼠受精卵发育4-5d胚胎细胞。 将ES细胞进行体外遗传操作后－>重新植回小鼠胚胎，可发育成胚胎的各种组织－>最后形成嵌合体小鼠（chimeric mouse）－>如果这种ES细胞能发育成小鼠的生殖细胞－>通过交配可得到基因剔除或替换的小鼠。

（二）打靶载体（正-负选择系统---PNS） 打靶载体含有两种筛选标志：neo阳性筛选标志；HSV－tk阴性筛选标志。 1.neo阳性筛选标志： 将neo基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生重组时－>neo基因也被插入到染色体－>因此发生同源重组的ES细胞能在含G418的培养基中生长。 2.HSV－tk阴性标志： HSV－tk是来源于单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）的胸腺嘧啶激酶基因，此基因产物可以分解单核苷酸类似物而产生毒性代谢产物。HSV－tk插入外源基因外测的载体序列中。当外源DNA与染色体上的同源序列发生同源重组时－>载体部分（含HSV－tk基因）是不能被整合到染色体中的。 如果细胞能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中；相反，如ES细胞在此种培养基中被杀死，说明载体部分没有插入基因组。

Knockout 应用举例 ★ 与肿瘤相关的基因敲除 p53基因敲除的纯合子鼠在6个月龄前易自发产生不同类型的肿瘤，尤其是淋巴瘤和肉瘤 用于在基因的层面上探讨肿瘤的发生机理

三、基因替换（knockin）研制转基因小鼠 应用以ES细胞培育技术和同源重组为基础，可将外源基因整合到特定的靶位点，利用靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的表达。 在通过与携带突变的LoxP序列的打靶载体进行Cre重组酶介导的重组时，可将外源基因引入特定的位点。 Cre/LoxP系统用于外源基因定位整合转基因小鼠的基本过程如下： （一）经过同源重组在染色体上引入一个LoxP位点 （二）将突变分别引入LoxP序列的左侧元件（LE突变Lox）或右侧元件（RE突变Lox）。 （三）LE突变Lox与RE突变Lox间重组将会产生一个野生型的LoxP以及一个LE＋RE突变Lox。 （四）Cre重组酶识别这两个位点并导致重组，在ES细胞中用这种方法定位整合杂交率达2％～16％，并可将外源基因整合到染色体上的任何位点。 （五）PCR法鉴定正确克隆，无须依赖于任何药物筛选。

基于Cre-LoxP系统的Conditional Knockin 是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶 策略的技术核心 。 Cre重组酶介导的DNA重组

四、基因打靶在医学中的应用 基因打靶技术最大的优势是能修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传。 （一）基因打靶与遗传病 通过基因打靶建立基因缺陷型的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠），研究遗传病的发生机制、分子基础及诊断的主要动物模型。 （二）基因打靶与肿瘤研究 利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性生长，从而研究肿瘤发生、转移及转归的分子机制。 （三）基因打靶与生物制药 有公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会和经济价值是无法估量的。

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四、转基因动物研究面临的问题 制作转基因动物效率低 这是制约这项技术广泛应用的关键。以显微注射法生产转基因动物为例，小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊转基因阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。

2. 基因在宿主基因组中的行为难以控制 转基因随机整合于动物的基因组中，很有 可能引起宿主细胞染色体的插入突变，还可造 成插入位点的基因片段的丢失及插入位点的基 因的位移，同时也可能激活正常情况下处于关 闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不 育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。

3. 转基因表达水平低 许多转基因的表达水平受到宿主染 色体上整合位点的影响，往往出现异位 表达，影响转基因的表达能力，从而使 大部分转基因表达水平较低,极少部分表 达水平过高。

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生物反应器 五、动物生物反应器 一般把目的片段在动物的器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器。

动物乳腺生物反应器 动物血液生物反应器 其他生物反应器

动物乳腺生物反应器 乳腺生物反应器是指将编码药用蛋白的外源基因与乳腺特异性启动子连接组成构件，通过转基因技术将此构件插入到胚胎的基因组内。当动物发育到性成熟期怀孕分娩后，乳腺泌乳，乳汁中含有该药用蛋白。 用蛋白分离纯化技术可以将动物乳汁中药用蛋白分离纯化，制成药物，因此有人形象地将乳腺生物反应器称之为“四条腿的工厂”。

如何实现外源基因的器官或组织特异性表达？ 转基因牛乳腺生物反应器的制备流程 如何实现外源基因的器官或组织特异性表达？

优点： ① 乳腺生物反应器生产目标产品的产量高，非常容易收获。 ② 动物乳腺生产的产品质量好，对需要生产的蛋白质进行了天然的后加工，如：剪切引导肽序列，进行糖基化、羧化、磷酸化和组装多聚体分子等一系列加工。 ③ 生产成本低

不足：

我国对动物乳腺生物反应器的研究颇为重视，施履吉院士早在80年代就提出乳腺生物反应器构想，并与他人合作成功地获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔。90年代,国家“863”高技术计划已将转基因羊－乳腺生物反应器的研究列入重大项目,并取得一系列可喜成果,中国科学院与扬州大学合作获得促红细胞生成素和人乙肝炎表面抗原基因两乳腺特异表达的转基因山羊。1998年上海医学研究所与复旦大学遗传所合作获得表达人凝血因子IX转基因山羊。

上海转基因动物 遍体白色，颈下的两个肉垂特征明显，除了个头略有大小，长得就像“孪生三兄弟”

可以用乳腺生物反应器生产的基因药物 1. α1-胰蛋白酶抑制因子（AAT） 2.人抗凝血酶Ⅲ 3.人组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA） 4.人乳铁蛋白（hLF）

动物血液生物反应器 目前已成功在小鼠、山羊、猪、牛、鸡及绵羊中生产了组织血纤维蛋白溶酶原激活因子和抗凝集因子(t-PA,血凝集因子Ⅷ和Ⅸ以及蛋白C)、人免疫球蛋白、α1－球蛋白、β－球蛋白、干扰素、胰蛋白酶、生长激素、磷脂蛋白、血红蛋白、乳铁蛋白等。 动物血液生物反应器血液量大，可作为转基因动物专一表达的组织之一，利用转基因猪血液生产人类血红蛋白已证明是可行的，不过血液生物反应器生产的蛋白质或多肽在血液循环时会影响动物的健康状况。