第六章 发酵动力学 发酵动力学 发酵动力学：研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。 第六章 发酵动力学 发酵动力学 发酵动力学：研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。 研究内容： 研究内容：1）微生物生长过程中的质量和能量平衡； 2）发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系； 3）环境因素对三者的影响； 4）工艺条件的控制。 研究目的：通过发酵动力学的研究来进行最佳发酵工艺条件的控制。发酵过程中菌体浓度、基质浓度、温度、pH值、溶解氧等工艺参数的控制方案，也需要在这些研究基础上进行优选。 研究目的：

第一节 发酵过程动力学描述 ▲一、得率系数（Y）和维持常数 1. 生长得率系数 符号：基质（S），菌体（X），产物（P） 第一节 发酵过程动力学描述 符号：基质（S），菌体（X），产物（P） ▲一、得率系数（Y）和维持常数 1. 生长得率系数 定义： 菌体的生长量相对于基质消耗量的收得率。 体现的是一时间段内的总体变化情况。 定义式为： （1） ——干菌体的生长量（以下同）

在分批培养中，M的组成时刻都在变化 ，因此 一般不为常数，某一时刻的 称为生物体的瞬时得率，其定义式为：

YP/S<YPS 2. 产物得率系数 定义：代谢产物合成量相对于基质消耗量的收得率。 分为实际产物得率和理论产物得率两种。 定义式分别为： YP/S<YPS （2） (-△S)P —用于合成产物所消耗的基质量 （3） 例如：10 g 葡萄糖中有 5 g 转化为产物（3 g），另5 g 生成了2 g 干菌体，则实际产物得率为 ，理论产物得率为 。 30 % ( 3/10) 60 % ( 3/5)

以上的得率系数是基于底物完全用于细胞生长和产物生成的假设，但实际过程中人们发现底物进入细胞体后，还要用于细胞的维持代谢。

3. 维持常数 ▲维持：指活细胞群体在没有实质性的生长（生长和死亡处于动态平衡）和没有胞外代谢产物合成情况下的生命活动（如细胞的运动、细胞内外各种物质的交换、细胞物质的转运和更新等）。 维持常数：单位质量干菌体在单位时间内因维持代谢消耗的能量。 （4） 高 m 越小，菌株的能量代谢效率越 。

▲二、比速率 1. 菌体比生长速率（μ） 菌体生长速率： g/h或g/(L·h) 菌体比生长速率： h-1

一般情况下，μ值并非常数，它受菌种特性、T、pH值、M组成及浓度等条件的影响。 但是，在分批发酵的对数生长期，μ一般为常数。 μ越大，说明这种M.B生长越快。

2. 基质比消耗速率（qs） 基质消耗速率: g/h或g/(L·h) 基质比消耗速率: h-1

3. 产物比生成速率（qp） 产物生成速率: 产物比生成速率 : 一般qP 是μ 的函数， （后详）

三、质量与能量平衡 1. 碳元素平衡 基质中的碳 菌体中的碳＋产物中的碳＋CO2中的碳 （5） — 第i 项基质的含碳量 — 每1 g干菌体内的碳含量 — 第 j 项产物的含碳量 — CO2的含碳量

2. 氮元素平衡 基质中的氮 菌体中的氮 + 产物中的氮 （6） —第i 项基质含氮量 —干菌体含氮量 —第j 项产物含氮量

－ΔS＝(－ΔS) G＋(－ΔS) M＋ (－ΔS) P （7） 3. 基质平衡 ▲发酵中的基质消耗通常用于菌体生长、活细胞维持、产物合成三方面： 若产物生成可以忽略（即以生产细胞为目的）则－ΔS＝(－ΔS) G＋(－ΔS) M －ΔS＝(－ΔS) G＋(－ΔS) M＋ (－ΔS) P （7） 取对发酵时间的微分形式，有： （8） 设YG 为细胞(菌体)的生长得率系数： YP 为产物得率系数：

YX/S和YP/S是针对总消耗的碳源而言的，而YG和YP分别是对用于细胞生长和产物形成所消耗的基质而言的。因此，后两者比前两者稍大。 （9） 取比速率形式（除以 X）得： （10）

4. 能量平衡 物质代谢的同时也伴随着能量代谢。

第二节 生物反应模式与发酵方法 ▲一、生物反应动力学分类 1. 根据产物形成与细胞生长是否耦联进行分类 （1）生长耦联型 有紧密联系 第二节 生物反应模式与发酵方法 ▲一、生物反应动力学分类 1. 根据产物形成与细胞生长是否耦联进行分类 发酵产物的生成速率与菌体生长速率之间大致存在三种不同类型的关联。 （1）生长耦联型 有紧密联系

— 以菌体细胞量为基准的产物生成得率 — 产物比生成速率 — 菌体（细胞）比生长速率 ∝ 代谢产物的生成速率与细胞生长速率直接有关。通常是初级代谢产物。主要供给细胞生长的一类物质，如乙醇、氨基酸、核苷酸等。

（2）非生长耦联型 qP ∝ X β — 非生长耦联的比生产速率（常数 ） 此类型中产物的生成速率只与已有的菌体量有关，产物产率和浓度高低取决于细胞生长期结束时的生物量。 该模式中，细胞生长时无产物；细胞停止生长后，产物大量积累。 但不是所有次级代谢产物一定是与生长无关联的 大分子类次级代谢产物，对细胞的代谢功能没有明显的影响，一般是在稳定期形成。如抗生素等。

（3）混合型 / 部分生长耦联型 α—与生长耦联的产物形成系数 β—非生长耦联的比生产速率 产物生成速率不但与菌体生长速率部分耦联，还与菌体积累量有关。 如乳酸、柠檬酸、Glu等的发酵。

分批培养中产物形成与细胞生长的关系 生长耦联型 非生长耦联型 混合型 / 部分生长耦联型

2. 根据产物形成与基质消耗的关系分类 即碳源利用与产物形成速率的关系 3种 表6-1 发酵过程的动力学分类 类型 特定的速率关系 Ⅰ 即碳源利用与产物形成速率的关系 3种 表6-1 发酵过程的动力学分类 类型 特定的速率关系 Ⅰ 产物形成与碳源消耗直接有关 Ⅱ 产物形成与碳源消耗间接有关 Ⅲ 产物形成与碳源消耗无关

（1）第Ⅰ型 第Ⅰ型又称生长相关型。 特点：是菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰，即表现出产物形成直接与碳源利用有关。 与碳源消耗有化学计量关系 又分为两种情况：菌体生长类型和代谢产物类型。 平行进行 比生长速率； 糖消耗速率； 产物比生长速率

（2）第Ⅱ型 第Ⅱ型也称生长部分相关型 。 特点：是M.B的生长和产物的形成是分开的，碳源的利用在这两个时期都很高。这类产物一般产量较高。 比生长速率； 糖消耗速率； 产物比生长速率

（3）第Ⅲ型 第Ⅲ型又称与生长不相关型。 特点：是产物形成是在菌体生长停止后。产物形成与碳源利用无准量关系。 次级代谢产物如抗生素、维生素多属于此类，最高产量一般不超过碳源消耗量的10%。 比生长速率； 糖消耗速率； 产物比生长速率

图6-1 按Gaden观点而进行发酵类型的分类 t/h 第Ⅰ型 第Ⅱ型 第Ⅲ型 a b c 图6-1 按Gaden观点而进行发酵类型的分类 比生长速率； 糖消耗速率； 产物比生长速率

二、发酵方法 1. 分批发酵法（batch fermentation ） ▲ 发酵方法有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵（流加发酵）等多种形式 。 1. 分批发酵法（batch fermentation ） 最为广泛使用 ▲定义：在一个密闭系统内一次投料，一次接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的发酵操作类型. 单罐深层分批发酵法

M.B经历着由生到死的一系列变化。 分批发酵过程中细菌的生长，可分为迟滞期、对数 生长期、稳定期和衰亡期。 非恒态/非稳态 发酵液中的细胞浓度、基质浓度和产物浓度均随时间而不断发生变化。如下图所示：

非恒态/非稳态 比生长速率 活菌数 培养时间（h）

2. 连续发酵法（continuous fermentation ） 定义：当微生物培养到对数生长期的后期时，以一定的速度向发酵罐内添加新鲜的无菌培养基，同时以相同速度从发酵罐中排出含有产物的培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。 开放系统 、F

同时，pH值、温度、M浓度、溶解氧等都保持恒定，因此菌体的生长速率是恒定的。 从定义知：当微生物培养到对数生长期时··· ··· 恒态 因此，M.B的生长和代谢终保持旺盛的稳定状态，能达到稳定高速培养微生物或产生大量代谢产物的目的。 连续发酵的优缺点：p150 表6-3 连续发酵 所使用的设备

和分批培养相比，连续培养的优点有： ① 可以维持稳定的操作条件，所以产品质量相对稳定； ② 能实现机械化和自动化，降低了劳动强度，减少了染菌机会； ③ 减少设备清洗、准备和灭菌等非生产时间，提高了设备利用效率； ④ 容易对过程进行优化。

连续培养法的缺点： ① 需要专门仪器，投资高； ② 由于是开放系统，加上反应周期长，容易染菌； ③ 在长周期连续培养中，菌种易于退化； ④ 营养物的利用率一般低于单批培养； ⑤ 新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，影响培养和营养物质的利用。

连续培养器的类型同样很多，如下表： 连续培养重要特征是使微生物增殖速度和代谢活性处于稳定状态。连续培养方法按控制方法可分为恒浊器法和恒化器法。

（1）恒浊培养 操作：通过光电管检测恒浊器中培养物的吸光值，M流速可自动调节，使培养物浊度或细胞密度保持在一个预先设定值（内控制 ） 。 原理：维持细胞（或菌）浓度不变（反映细胞浓度的浊度）。 特点：基质过量，菌以最高速率生长；但工艺复杂，烦琐。主要应用于工业生产。

（2）恒化培养

营养物质更新的速度叫稀释率（D） 概念：利用恒化器进行连续培养时，向其中加入无菌新鲜M的速度（外控制 ）与排出含菌培养液的速度相同，将M中的某种生长限制因子（如碳源、氮源、生长因子、无机盐等）的浓度控制在恒定范围。 原理：恒化器内M.B生长速度由向容器中加入新鲜M的速度决定，最终细胞浓度依赖于限制性营养物的浓度。 特点：维持营养成分的低浓度，控制微生物生长速率（低于最高速率）。主要应用在实验室。

3.补料分批发酵法（fed-batch fermentation ） 又称半连续发酵法或流加发酵法 ▲定义：在微生物的分批培养过程中，向发酵罐中间歇或连续地补加一种或多种无菌的限制性底物，直到培养结束后才排出培养液的一种发酵操作方式。 流加发酵操作能使发酵系统中保持低的营养物浓度。 一方面可解除底物的抑制、产物的反馈抑制和Glc分解阻遏效应； 另一方面又避免了培养基积累某些有毒代谢物，而且还可以起到稀释发酵液以降低粘度的作用。

由于流加发酵可以延长细胞对数生长期和平衡期的持续时间，增加生物量和细胞代谢产物的积累，因此发酵工业中广泛采用这种培养方式进行生产。 GSH的分批发酵过程 高浓度葡萄糖恒速流加下GSH发酵过程

补料分批发酵的类型 按补料方式分： 连续补料、不连续补料和多周期补料等； 按补料速率分： 快速补料、恒速补料、指数速度补料和变速补料； 按反应器中发酵液体积分： 变体积补料和恒体积补料； 按反应器数目分： 单级补料和多级补料； 按补加的培养基分： 单一组分补料和多组分补料等。

第三节 微生物发酵动力学 一、分批发酵动力学 1. 分批发酵的不同阶段 （1）迟滞期 （2）对数生长期 第三节 微生物发酵动力学 一、分批发酵动力学 1. 分批发酵的不同阶段 （1）迟滞期 适应新环境 X几乎没有增加 细胞个体增大 合成有关水解酶来利用营养物质 迟滞期长短与……有关。 （2）对数生长期 活力旺盛 快速分裂繁殖 显示对数生长

在此阶段，培养基成分虽然发生改变，但细胞的生长速率维持恒定且达到最大。当培养基中营养物过量时，生长速度与营养物浓度无关： 积分得： 如果细胞数量倍增，X2＝2X1，则所需要的倍增时间td 为：

（3）稳定期 一般说来，细菌的倍增时间为15 ~ 60 min，酵母为45 ~120 min，霉菌为2~8 h。p155表6-6 营养物消耗或有毒物质形成，生长速度下降直至停止。这时细胞增加速度和死亡速度达到平衡，进入稳定期。DCW基本恒定，细胞性能相对稳定。 由于细胞的自溶作用，胞内的一些物质可以作为尚存活细胞的营养物质而继续缓慢地生长 二次生长

二次生长的生长曲线 （4）衰亡期 能量耗完和有毒物质积累，细胞开始自溶而死亡。时间长短取决于M.B的种类和M的类型。

延迟期： 稳定期 衰亡期 对数生长期: 菌体浓度 对数生长期 稳定期： ; 延迟期 衰亡期: 时间

2. 微生物分批培养的生长动力学 ★（1）Monod方程式 1942年，Monod最先发现，μ与 [S]符合以下方程： —— 菌体最大比生长速率 h-1 —— 饱和常数 g/L或mol/L [S] —— 生长限制性基质的浓度 g/L或mol/L

Monod方程式与酶学中的米氏方程十分相似，但属于经验式。 Monod方程式是目前应用最为普遍的微生物生长动力学方程式，表达了微生物比生长速率与生长限制性基质（一般为C源）浓度之间的定量关系。

当 时， KS = [S] 是当比生长速率μ达到最大比生长速率μm一半时的生长限制性基质浓度。 可见，饱和常数KS 的物理意义 的大小表示了微生物对基质吸收亲和力的强弱。

大多数M.B的KS是很小的（一般为0.1~120mg/L或0.01~3.0 mmol/L），表明M.B对营养物有较高的吸收亲和力 。 μm 随M.B的种类和培养条件而异。 种类：比如细菌的μm大于真菌的μm。 培养条件：对同一M.B而言，T升高，μm增大； 营养物质容易被利用时μm较大。

! Monod方程成立是基于以下假设：只适用于单一基质限制及不存在抑制性物质的情况。也就是说，除了一种生长限制性基质外，其它必需营养都是过量的，但是这种过量又不致引起对生长的抑制，在生长过程中也没有抑制性产物生成。 i） 当限制性基质浓度[S] 很低时，[S] << KS KS + [S]≈KS，Monod方程可以简化为： μ ∝[S]

ii）当限制性基质浓度[S]很大时，[S] >> KS KS + [S]≈[S] ，Monod方程可以简化为： 但实际中通常并非如此，因为[S]很大时，容易产生基质抑制或产物抑制。 实际中的μ~[S]曲线如课本p156图6-9所示。

（2）动力学参数的确定 利用双倒数作图法可求出 KS 和μm。将Monod方程两边同时取倒数，有： [S]已知，μ可由实验计算得出： ~ 的关系图

例：在一定条件下培养大肠杆菌，测得实验数据如下： S (mg/L) 6 13 33 40 64 102 122 153 170 221 μ(h-1) 0.06 0.12 0.24 0.31 0.43 0.53 0.60 0.66 0.69 0.70 求在该培养条件下，大肠杆菌的μm、Ks和 td?

Monod方程式是在假设的基础上成立的，没有考虑很多因素（比如维持代谢、延滞期等），实际上除了Monod 方程式，还有许多有关细胞比生长速率（μ）与限制性基质浓度（[S]）关系的方程式。 当存在多种限制性基质时，方程可改写为：

（3）其它生长动力学方程式 ① 菌体自身抑制（种群竞争） 菌体浓度的增加对自身生长也会产生抑制作用，此时可以用Logistic方程较好地进行描述。 ② 基质抑制生长动力学

③ 产物抑制生长动力学 当微生物生长被其自身代谢产物抑制时，有以下几种动力学方程式可以表达： Ki’—产物抑制常数 L/g 或 L/mol [P]—产物浓度 g/L 或 mol/L

3. 微生物分批培养的基质消耗动力学 或 P165 通常 YG 和 m 很难测定 ∵ ∴ 所以由 曲线双倒数作图可求出YG 和 m

4. 分批培养的产物形成速率 Leudeking和Piret模型。这一经典模型用于描述微生物代谢产物的生产。它把产物形成速率看作是菌体生长速率和菌体量的函数。用数学式表示为： 取比速率形式： ——与菌体生长速率关联的产物合成常数 ——与菌体生长量关联的产物合成常数

按不同的α和β常数值可将上述产物合成动力学分为以下几种类型： ① 当 α> 0，β = 0 时，为生长耦联型； ② 当 α> 0，β > 0 时，为部分生长耦联型； ③ 当 α= 0， β > 0 时，为非生长耦联型。

5. 分批培养的细胞死亡动力学 — 细胞死亡常数 —细胞比死亡率 h-1 —细胞最大比死亡率 h-1

6. 分批培养的生产率（生产强度） （g·h-1·L-1） 生产时间 在计算时间时，不仅包括发酵时间，还应包括放罐、清洗、装料和消毒时间以及迟滞期所消耗的时间。

二、连续发酵动力学 1、单罐（级）连续发酵动力学 、F X0 = 0 F：培养基的流速（L·h-1）

前提和假设： a）在稳定状态下单罐连续发酵的物料平衡，各参数变化为0； b）假定培养基中每一点浓度都没有差别，即完全均匀混合或匀态，也指连续发酵过程中菌体、基质、氧等在培养基中均是混合均匀的； c）假定细胞完全没有死亡（比死亡速率μd＝0），即连续发酵物料平衡中的死亡菌数量为0。

积累的细胞＝流入－流出＋生长－死亡的细胞 （1） 细胞的物料平衡 、F 积累的细胞＝流入－流出＋生长－死亡的细胞 即 以及罐内 式中，X0、X—分别表示流入和流出发酵罐的细胞浓度(g/L); F—培养基流速(L/h)；V—罐内发酵液体积(L) μ和μd分别为比生长速率和比死亡速率（h-1）

对于普通单级恒化器发酵而言，料液为新鲜培养基，即X0＝0；在大多数连续培养中，μ>>μd，则上式可简化为： 定义稀释率 （h-1） ， 在恒定状态时， 则有： μ＝F/V ★ 即在恒定状态时（或者说连续发酵时）， μ＝D 在一定范围内，人为调节培养基的流加速率F（因D＝F/V，而V一般不变），可使细胞按所希望的比生长速率μ来生长。

稀释率D的单位与比生长速率μ的单位相同，都为h-1，其含义为单位时间内新进入的培养基体积（F）占罐内培养液总体积（V）的分数。 D的倒数（1/D），表示培养液在罐中的平均停留时间（h）。

若μ>D，则dX/dt>0，培养液中微生物浓度将随时间而增加；

（2）限制性营养物的物料平衡 积累的营养物＝流入―流出―生长消耗―维持所需 ―形成产物消耗的营养物 S0、S—分别表示流入和流出发酵罐的营养物浓度(g/L)； F—培养基流速(L/h)； V—罐内发酵液体积(L)； YX/S为细胞的得率系数； YP/S为产物的得率系数； qp为产物的比生成速率。 以及罐内 、F

通常，对限制性基质的维持需求往往是很低的（即mX<<μX/YX/S），而且形成的产物也可忽略。故在恒定状态下（dS/dt＝0），上式可简化为： （1） 要求会推导此式

（3）细胞浓度与稀释率的关系 为了使细胞浓度X、营养物浓度S和稀释率D关联起来，需要利用Monod方程 把 D＝μ代入得： （2） DC为临界稀释率，即在恒化器中可能达到的最大稀释率 DC通常相当于分批发酵中细胞的最大比生长速率μm， 即 μm= DC

∴ 将μm= DC带入（2）式得： （3） 将（3）式带入（1）式 可得到： 细胞浓度X为： （4） 要求会推导此式 将（3）式带入（1）式 可得到： 细胞浓度X为： （4） 要求会推导此式 可见，（3）式和（4）式分别表示了S 和X对稀释率D（或培养基流速）的依赖关系。具体情况是：

（2）当D增加时，对X来说，起初X呈线性慢慢下降，当D＝DC＝μm时，X→0，即达到清洗点，培养液中微生物全部被冲出； （3） （4） 可见： （1）当D很小时，S→0，营养物全部被细胞利用，而细胞浓度X＝S0YX/S； （2）当D增加时，对X来说，起初X呈线性慢慢下降，当D＝DC＝μm时，X→0，即达到清洗点，培养液中微生物全部被冲出； 而对S来说，起初S随D的增加而缓慢增加，但当D＝μm时，S→S0，营养物几乎没利用。

稀释率（D）对营养物浓度（S）和细胞浓度（X）的影响

2. 连续发酵生产率与分批发酵生产率的比较 在工业生产中，连续培养主要用于生产微生物菌体或细胞。 连续培养的生产率： （5） 将（4）式带入（5）式得： （6） 为得到最大生产率Pm，可求（6）式的一阶导数并使其为零，由此得到Dm，将Dm代入（4）式可得到Xm，从而得到Pm。 通常，μm越大，采用连续培养越有利。

三、发酵工艺最优化控制 1、明确控制目标 2、明确影响因素 3、确定实现目标值的方法 4、确定最佳工艺 5、实施最佳工艺 qP 三高：产量、产率、效率 2、明确影响因素 影响qP的主要因素：理化因素、生物因素 3、确定实现目标值的方法 目标值包括qPm和μm 4、确定最佳工艺 营养条件和环境条件 5、实施最佳工艺