细胞增殖、分化、凋亡异常与疾病

Evan, GI and Vousden, K. (2001) Nature 411:342 肿瘤的发生过程 Evan, GI and Vousden, K. (2001) Nature 411:342

增殖 分化 细胞 凋亡

细胞异常增生与疾病 【细胞增殖】 细胞分裂和再生的过程，细胞通过分裂进行增殖，把遗传信息传给子代，保持物种的延续和数量增多。

细胞周期分期 M-期 有丝分裂 胞质分裂 间期 G1 = M和S期间的间隔 S = DNA和中心体复制 G2 = S和M期间的间隔

有丝分裂 分裂间期 前期 前中期 中期 后期 末期 胞质分裂期

2001 诺贝尔奖 Leland H. Hartwell 1970s “检查点” 酵母遗传学 ~100 CDC 基因 始动基因 Paul M. Nurse 1970s CDKs 酵母 Tim Hunt 1980s Cyclins 海胆

细胞周期调控 细胞周期素（Cyclins） 细胞周期素依赖的蛋白激酶 (CDKs) 细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制子(CDKIS)

Cyclin B1、Cyclin A、Cyclin E、Cyclin D1,D2,D3. F,G,H,T. ●细胞周期素 【类型 】 Cyclin B1、Cyclin A、Cyclin E、Cyclin D1,D2,D3. F,G,H,T.

Cyclin Protein kinase process regulated Cyclin D1-3 Cdk 4,6 G1-phase progression Cyclin E Cdk2 G1 to S-phase S-phase progression Cyclin A Cdk2 Cyclin A Cdk1 S through G2 Cyclin B Cdk1 M-phase

细胞周期素的降解: 蛋白酶体介导的泛素化降解

用实验在哺乳动物细胞中证实Cyclin D 是细胞通过限制点所必须的

【CDK1活化启动cell cycle】 CDK1活化 Cell cycle Cyclin B与CDK1结合、磷酸化 ●细胞周期素依赖的蛋白激酶（CDKs） CDKs 是一类丝氨酸，苏氨酸依赖的蛋白激酶。 【CDK1活化启动cell cycle】 Thr14、Tyr15抑制部位去磷酸化 Cyclin B与CDK1结合、磷酸化 CDK1活化 CAK对CDK1活化部位的磷酸化 Cell cycle CDK活化激酶（CDK activation kinase CAK）

【CDK活化与调控细胞周期】 活化部位(CDK1Thr161)和抑制部位(Thr14、Tyr15)磷酸化 【CDKs活化部位与抑制部位】 CAK对CDK1活化部位磷酸化活化，同时伴有抑制部位磷酸化活化。 活化部位(CDK1Thr161)和抑制部位(Thr14、Tyr15)磷酸化 ▲抑制部位（CDK1Thr14、Tyr15）去磷酸化依赖P80cdc25酶作用 【CDK活化与调控细胞周期】 ▲ CDK2与cyclin E结合， CDK4、CDK6与cyclin D1、D2、D3结合 pRb磷酸化 游离E2F释放↑ 启动G1期 DNA合成 启动S期 ▲CDK2与cyclin E和A结合后 识别染色体ARS 促进S期 ▲CDK1与cyclin B1结合(Maturation promoting factor,MPF) 启动M期 ▲CDK1与cyclin A结合 启动G2期 磷酸酶P80cdc25

CDI可特异性抑制CDK的活性。 【抑制途径】 合物的磷酸化活化部位，抑制CDK 的激酶活性。 阻断它与cyclins的结合。 ●CDI ▲Ink4：P16INK4a、P15INK4b、P18INK4c和P19INK4d CDK4、CDK6 ▲Cip/Kip：p21Cipl、P27Kip1和P57Kip1 CDK2 【抑制途径】 ▲ CDIs通过直接结合CDK-cyclin复 合物的磷酸化活化部位，抑制CDK 的激酶活性。 ▲ P16INK4a通过结合CDK4单体， 阻断它与cyclins的结合。

细胞内存在监控机制—检测点（Checkpoint）。 ■细胞周期检查点（Checkpoint of cell cycle） 细胞内存在监控机制—检测点（Checkpoint）。 DNA 损伤检查点 G1/S Checkpoint DNA复制检查点 S/G2 纺锤体组装检查点 G2/M 【检查机制】 ● P53：能与DNA损伤部位结合的AMT 磷酸化P53，磷酸化P53上调 p21Cipl基因的转录，P21Cipl能与多种 CDK-cyclin复合物结合，抑制CDKs的激活，阻滞G1/S的过渡，为DNA修复提供足够时间。

DNA 损伤, 其它刺激 p53 p21 生长信号 cyclin/ CDK G1 期 S 期

►细胞周期异常与疾病（Abnormal cell cycle & diseases） 细胞过度增殖或不足的本质是细胞周期调控异常。 【Deregulation of cell cycle】 ■细胞周期的驱动失控（Cyclin、CDK和CDI表达异常） ■监控（检查）机制受损（The impairment of checkpoint system） 细胞增殖分化异常与相关疾病 增殖异常 分化异常 增殖分化异常 再生障碍性贫血 肥胖症 恶性肿瘤 白癜风 遗传性血红蛋白病 银屑病 前列腺肥大 肌营养不良 畸胎瘤 动脉粥样硬化 先天畸形 家族性红细胞增多症 X-连锁-球蛋白缺乏症 高IgM血症

恶性肿瘤 肿瘤是一类细胞周期调控异常的疾病。

1．细胞周期驱动机制失控 ■ cyclins 过表达 【Cyclin D1 过表达】（癌基因） ▲基因扩增（主要原因） ●染色体重排 Cyclin D1基因倒位于甲状旁腺启动子控制下 Cyclin D1 合成增加 甲状旁腺腺癌 ●染色体易位 t(11:14) (q13:q32) Cyclin D1受Ig重链基因增强子影响 Cyclin D1 过表达

【Cyclin D过表达致肿瘤机制】 Cyclin D1 T286突变 Cyclin D1泛素化受阻 Cyclin D1↑ ▲基因突变 Cyclin D1 T286突变 Cyclin D1泛素化受阻 Cyclin D1↑ 【Cyclin D过表达致肿瘤机制】 Cyclin D过表达 + 生长因子 CDKs瀑布效应↑ 细胞增殖过度 易发生细胞癌变 ■ CDK 表达异常 主要见于CDK4、CDK6过表达。 CDK4↑+ cyclin D结合↑ CDK4/cyclin D↑ CDKs表达↑ pRb pRb磷酸化↑ 细胞增殖过度 E2F ↑ G1/S过渡加速

p16 InK4基因表达↓ CDK4与cyclin D结合↓ 细胞周期处在“易于”被启动状态 易发生细胞癌变 ■ CDI表达不足和突变 肿瘤细胞中常出现CDI（肿瘤抑制基因）表达不足或突变。 ▲ InK4失活 【p16 InK4基因失活原因】 突变或缺失、染色体易位、p16 InK4高度甲基化。 【Mechanism】 p16 InK4基因表达↓ CDK4与cyclin D结合↓ 细胞周期处在“易于”被启动状态 易发生细胞癌变

增殖细胞核抗原（PCNA） 阻滞DNA复制 ▲ Kip/Cip含量减少（Deficient expression of Kip/Cip） P21cipl功能 cyclins/CDKs活性↓ 细胞周期速度↓ 增殖细胞核抗原（PCNA） 阻滞DNA复制 【Mechanism】 p53基因突变 P21cip1转录↓ DNA受损细胞增殖↑ 2. 细胞周期监控机制受损(Impairment of checkpoint system) 主要原因：G1/S、G2/M检查点异常 失察结果：探测DNA损伤功能降低 （如发现不了DNA损伤，会导致基因缺失、易位、染色体重排等）

Table 8.3 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Table 8.4 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

细胞凋亡 下调bcl-2表达、激活bax 基因 P53 ■G1/S交界处失察 ▲P53 进入S期 DNA损伤 修复成功 G1/S检查 停顿G1期 损伤DNA修复 修复失败 细胞凋亡 下调bcl-2表达、激活bax 基因 P53 ▲P53突变或丢失 易发生细胞癌变 致变剂 检测点检查功能↓ 遗传不稳定性 复制忠实性↓

DNA病毒: SV40、HPV、腺病毒等 P53蛋白失活 肿瘤型 突变频率（%） 突变热点 肿瘤型 突变频率（%） 突变热点 肺癌 56 157，248，273 前列腺癌 30 不确定 结肠癌 50 175，245，248，273 肝细胞癌 45 249 食道癌 45 不确定 胶质癌 25 175、248 卵巢癌 44 273 乳腺癌 22 175、248、273 胰腺癌 44 273 子宫内膜癌 22 248 皮肤癌 44 248、278 甲状腺癌 13 248、273 胃癌 41 不确定 白血病 12 175、248 头颈鳞癌 37 248 宫颈癌 7 273 膀胱癌 34 280 软组织肉瘤 31 不确定 DNA病毒: SV40、HPV、腺病毒等 P53蛋白失活

■ G2/M 交界处失察 G2/M交界处 DNA双链断裂 激活DNA损伤检查点 阻止细胞进入M期 诱导修复基因转录 完成断裂的DNA修复

原发性血小板增多症（PT） 小板持续增多和血小板功能异常，有反复自发性 出血及血栓形成。 ■临床症状：以巨核细胞增殖为主的骨髓增生性疾病。伴有血 小板持续增多和血小板功能异常，有反复自发性 出血及血栓形成。 ■ 发病机制： X染色体遗传、TGF-减少、辅助细胞缺乏等。 JAK2 V617F突变导致JAK2持续激活，通过 JAK/STAT通路，调节cyclin D表达，刺激细胞增殖。

《细胞凋亡与疾病》 【细胞凋亡的概念】 由于体内外生理或病理因素触发细胞内预存的死亡程序而 导致的细胞主动死亡过程。 【凋亡的生理学意义】 ■参与发育、生长。 ■维持内环境稳定。 ■参与防御反应。

“为他们在器官发育遗传调控和细胞凋亡方面的发现” 2002年生理和医学诺贝尔奖 1090 –131= 959(cells) Robert Horvitz John Sulston Sydney Brenner “为他们在器官发育遗传调控和细胞凋亡方面的发现”

（二）凋亡时细胞的主要变化（Features of apoptosis cells） 1. 形态学改变 （The morphologic characteristics of apoptosis） ■凋亡细胞（实体细胞）与周围细胞脱接触 ■胞膜空泡化（Blebbing） ■细胞固缩（Condensation）、核固缩和发芽 ■凋亡小体（Apoptotic small body） 凋亡细胞(扫描电镜) 凋亡细胞(透射电镜) APL Apoptosis

1）DNA片段化（DNA ladding pattern） 2. 生化改变（The biochemical characteristics of apoptosis） 1）DNA片段化（DNA ladding pattern） 激活核酸内切酶 核小体连接区发生DNA降解， 寡核小体片段（160～200bp的倍数）

2）细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻 正常细胞膜上的磷脂是不对称分布的，鞘磷脂与磷脂酰胆碱在外层，磷脂酰丝氨酸（PS）在内层。

3）凋亡蛋白酶的激活及作用 Caspase (cysteine-containing aspartate-specific protease) 犹如计划周密和指挥有力的军事行动一样，Caspase是细胞凋亡的中枢，通过切断与周围细胞联络、重组细胞骨架、关掉DNA复制和修复、破坏 DNA和核结构等，在细胞凋亡中发挥重要作用。

三、影响细胞凋亡的因素（The mainly induced factors of apoptosis） Table：Influence of factors of apoptosis 诱导性因素（Inducers） 抑制性因素（Inhibitors） 理化因素 射线、高温、强酸、 细胞因子 IL-2、NGF等 强碱、应激、抗癌药 激素 ACTH、睾丸酮、雌激素 激素和因子 糖皮质激素、TNF 其它 Zn2+、苯巴比妥、半胱氨 免疫性因素 CTL分泌的粒酶 酸蛋白酶抑制剂、EBV、 病原体因素 HIV、HCV 牛痘、病毒、中性氨基酸

1. Caspase依赖的细胞凋亡（Caspase-independent apoptosis） 四、细胞凋亡信号传导通路 1. Caspase依赖的细胞凋亡（Caspase-independent apoptosis） （1） Concept, Classification, Construction of Caspases ■ 概念：Caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，14个成员。 ■ Caspase通路分类 上游（Caspase-8 , -9, -10） 下游（Caspase -2, -3,-6,-7）（共同通路） ▲ Caspase （Ced-3亚家族） 死亡受体通路 线粒体途径 大小亚基结合（二聚体） caspase激活（四聚体） ■ Caspase激活形式 Pro-caspase： NH2末端结构域、 20KD亚基、 10KD亚基 剪切

（2）死亡受体通路（Extrinsic or cytoplasmic pathway） ■死亡受体 TNFR、FasR、DR3、DR4、DR5等 是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的跨胞膜蛋白。 ■通路（pathway） FSAL FADD Pro-caspase-8 Caspase-8 Caspase-3 Pro-caspase-3 细胞凋亡 生长因子、信号、Fas抗体 FasR FADD（Fas-associated death domain）； DD（death domain）； DED （death effector domain）。 DED DD

+ （3）线粒体途径（Intrinsic or mitochondrial pathway） Bid Caspase-8 + ATP NO 缺氧 活性氧 应激 Bid Caspase-8 膜通透性↑、线粒体肿胀、△m↓ MPT开放 Cyt.c ATP Apaf-1 + AIF caspase-非依赖凋亡 Apaf-1活化 Cyt.c CARD Apoptosome Apaf-1活化 Cyt.c + Pro-caspase-9 Caspase-9 Pro-Caspase-3 凋亡 Caspase-3

（4）Activation of caspase-3（共同通路）(Effector caspase) Pro-caspase-3 caspase-9 Pro-caspase-9 Caspase-3 Pro-caspase-6 Caspase-6 Pro-caspase-7 caspase-7 剪切细胞内结构蛋白 Pro-caspase-2 caspase-2 ICAD（抑制性 CAD） CAD（ caspase活化DNA酶） CAD进入细胞核内降解DNA 细胞凋亡

2．非Caspase依赖的凋亡信号传导通路 ■钙超载 激活Ca/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA；激活 谷氨酰胺转移酶有利于凋亡小体形成；活化核转录因 子，加速凋亡相关因子合成。 ■凋亡诱导因子（AIF）

钙超载引起凋亡机制 TNF-α、抗CD3抗体、TCDD等 胞浆[Ca2+] ↑ 细胞凋亡 于凋亡小体形成； 割DNA。 ■激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链； ■激活谷氨酰胺转移酶，促使细胞骨架分子之间发生广泛交联，有利 于凋亡小体形成； ■激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录； ■在ATP参与下，暴露出核小体之间的连接区，有利于DNA内切酶切 割DNA。 细胞凋亡

五、细胞凋亡的触发机制（Mechanism of apoptosis ） 1．氧化损伤（Oxidation damage ） 氧自由基破坏了机体正常的氧化/还原动态平衡，造成生物大 分子的氧化损伤，形成严重的氧化应激状态。 【Mechanism】 激活p53基因、消耗ATP、生物膜脂质过氧化、激活核酸内 切酶,启动细胞凋亡。 各种氧化剂、缺氧等直接通过氧化损伤诱导细胞凋亡。 2．钙超载（Calcium overload ） 3．线粒体损伤（ Mitochondria damage ）

（Regulated mechanism of apoptosis） 六、细胞凋亡的调控机制 （Regulated mechanism of apoptosis） 【调控基因】 表 1 细胞凋亡的调控基因 功能 基因 抑制凋亡基因 Bcl-2 Bcl-XL、A1/Bfl-1、Bcl-w、Bcl-G和Mcl-1等 促凋亡基因 P53、Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Bik、Bok、 Bcl-B、Bcl-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa等 双向调控基因 c-myc、Bcl-x

1．Bcl-2基因家族（Bcl-2 Family & regulating functions） ■ Bcl-2（Bcl-XL）能够抑制线粒体MPT开放，Cyt.c 、AIF释放↓ ■ Bcl-2能够结合和灭活Apaf-1，阻断对caspase-9活化 Bcl-2 ■ Bcl-2也能特异地结合细胞色素C CARD MPT开放 膜通透性↑、线粒体肿胀、△m↓ Cyt.c ATP Apaf-1 + Apaf-1活化 Pro-caspase-9 Apoptosome AIF Caspase-9 Pro-Caspase-3 Caspase-3 凋亡 caspase-非依赖凋亡

2．p53基因（抑癌基因） 【促凋亡机制】 达，并触发细胞色素C释放和caspase活化。 作为一个转录因子，p53 调节一系列在细胞周期阻滞，DNA修复和细胞凋亡中起重要作用的基因。在DNA损伤后， p53 使细胞停在某个监测点直至损伤修复。如果损伤是不可逆的则诱导细胞凋亡。 【促凋亡机制】 ■ P53通过与Bcl-2基因相互作用，下调Bcl-2的表达。 ■ P53诱导细胞凋亡的靶蛋白表达（线粒体和死亡受体介导）。 ■ P53诱导线粒体内凋亡的相关蛋白（Bax、NOXA、 PUMA）表 达，并触发细胞色素C释放和caspase活化。 ■ P53诱导死亡受体Fas表达。 ■ P53能使死亡受体再定位于细胞膜上。

（Diseases associated to apoptosis deregulation） 七、细胞凋亡异常和疾病 （Diseases associated to apoptosis deregulation） 表： 与细胞凋亡异常相关的疾病 凋亡不足 凋亡过度 肿瘤 肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌 发育异常 气管-食管瘘、房（室）间隙缺 、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前 损、唇（腭）裂、短肢畸形、 列腺癌等 尿道下裂以及多囊肾等 发育异常 先天性消化道、胆道、肛门狭 CNS Alsheimer病、Parkinson 病、 窄或闭锁、动脉导管未闭、两 肌萎缩性侧索硬化症、色素性 性畸形、甲状舌骨囊肿等 视网膜病，脊肌肉萎缩、早老 免疫系统 系统性红斑狼疮、糖尿病、类 性痴呆 风湿性关节炎、桥本甲状腺炎 免疫系统 免疫缺陷病、AIDS 、多发性的硬化症等

（一）细胞凋亡不足（Apoptosis inhibition） 1. 肿瘤（Tumor） ■ bcl-2基因过表达 85%滤泡状和20%弥漫性B细胞淋巴瘤 染色体t（14;18）易位 bcl-2基因受到Ig基因增强子控制 肿瘤发生 细胞凋亡速率↓ bcl-2基因高表达 （乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在Bcl-2高水平表达） 存在 ■ p53基因缺失或突变 调节P53的稳定性、细胞内定位或（和）活性发生异常 p53表达或功能存在缺陷 细胞凋亡速率↓ 肿瘤发生 （50%以上恶性肿瘤中存在P53异常）

HBV编码的HBX是Caspase-3的强效抑制物，与肝癌发生密切相关。 ■病毒的癌基因 HBV编码的HBX是Caspase-3的强效抑制物，与肝癌发生密切相关。 ■异常融合蛋白 慢性髓细胞性白血病（CML） 染色体易位t (9；22)( Ph染色体) Bcr-abl融合基因 NF-B活化、细胞凋亡速率↓ 表达和产生p210 Bcr-abl蛋白质 CML髓系祖细胞的克隆扩增 肿瘤发生 存在 细胞凋亡抑制除了参与肿瘤的发病过程，也涉及癌细胞的转移发生。

2．自身免疫病（Autoimmune diseases） 针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除，机体产生了针对自 身抗原的体液免疫和细胞免疫，导致器官组织损伤。

（二）细胞凋亡过度（Apoptosis excess） 1.心肌缺血与缺血-再灌注损伤 ■特点 ▲缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞的坏死为主。 ▲在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主； ▲轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主； ■机制 ▲氧化应激、▲FasR通路、▲p53基因的转录增加。

《细胞分化调控异常与疾病》 ►概念与特点（Concept） 在细胞增殖时，子代细胞在形态、结构和生理功能上产生差异的过程。 细胞分化过程是由一系列基因产物（regulatory proteins）调控的。每 个基因的表达都必须：在正确的细胞中；在正确的时间；对正确的信号 产生正确的反应；产生正确的表达水平。

例子：眼形成的关键调控蛋白Ey（果蝇） ey 基因 早期细胞（发育成腿） 腿中眼细胞分化 眼形成

Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors Cell 2007,131,861-872 （Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc ）

►细胞分化的机制 3. 细胞间相互作用 1. 细胞决定（Determination）的选择作用 序表达，具备向某一特定方向分化的能力。 “决定”先于分化。 2. 细胞质在决定细胞差别中作用 由于干细胞在分裂时，细胞质分配的不均匀，导致子代干细胞的 胞质组分（细胞质决定子）不同，导致子细胞产生差别。 3. 细胞间相互作用 细胞分化与细胞所在位置及与其他细胞的联系有关。其效应可以 是细胞间直接接触所进行信息转导，也可以是细胞外物质的作用结果。

（Regulation on transcription and post- transcription levels） ►细胞分化的调节 1. 基因水平调控（Regulation on the genomic level） ■ 看家基因（与分化关系不密切） 编码维持细胞活动所必需的结构和功能蛋白质的基因以及一些不编码蛋白却参与蛋白质合成的tRNA、rRNA基因。 ■组织专一基因（与细胞分化关系密切） 2. 转录和转录后调控 （Regulation on transcription and post- transcription levels） ■转录水平调控（对专一基因的启动子和增强子进行调控） ■转录后水平调控（对mRNA前体处理、加工和iRNA调节）

3. 翻译与翻译后水平调控 4. 细胞外因素调控 （Extracellular factors that control differentiation） 细胞外信号物质、基质和营养因素等可改变细胞分化状态。

Hematopoiesis

“在得到尽快诊断和充分治疗的情况下，急性早幼粒细胞白血病 (AML M3) 是目前成人白血病中治愈率最高的白血病。” Parmar S, Tallman MS. , 2003 急性早幼粒细胞白血病

1988: APL的治疗在中国取得突破

1990: 多个研究组发现 t(15; 17) 易位

ATRA诱导APL病人缓解的机制? PML-RARa 诱导 APL发生的机制? 药物 基因 ATRA诱导APL病人缓解的机制? PML-RARa 诱导 APL发生的机制?

肺纤维化（Pulmonary fibrosis） 肺血管受损 纤维蛋白酶↑↑↑ 肺血管受损 纤维蛋白酶↑↑↑ 成肌纤维细胞 成胶原细胞 胶原蛋白 沉积 机体缺氧 气体弥散障碍 肺泡膜增厚 肥胖症（Morbid obesity） 前脂肪细胞过度向脂肪细胞分化，导致脂肪组织内脂肪细胞 数量增加。