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细胞增殖和细胞周期 细胞生物学教研室 邵阳光
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第三节 细胞周期的调控 ●细胞周期调控的主要研究内容 ●细胞周期调控系统的主要作用 ●MPF
第三节 细胞周期的调控 ●细胞周期调控的主要研究内容 ●细胞周期调控系统的主要作用 ●MPF ●Cyclin-Cdk复合物的多样性及细胞周期运转 ●细胞进出S期的调控 ●细胞周期运转的阻遏(细胞周期运转的负调控) ●发生在G1期的细胞周期调控事件 ●细胞周期检验点(Cell Cycle Checkpoint)
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细胞周期调控的主要研究内容： 一、寻找与细胞周期调控密切相关的基因及其表达蛋白，研究它们在细胞周期中的动态变化及相互作用的规律
二、这些基因和蛋白如何启动和影响细胞周期各时相发生的分子事件，进而影响细胞周期的表型 三、内外环境因素是怎样通过细胞内信号传递系统影响细胞周期的
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细胞周期调控系统的主要作用 和蛋白,然后自身失活(正调控) ◆确保每一时相事件的全部完成(负调控)
◆在适当时候激活细胞周期各个时相的相关酶 和蛋白,然后自身失活(正调控) ◆确保每一时相事件的全部完成(负调控) ◆对外界环境因子起反应(如多细胞生物对增殖信号的反应)
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一、MPF的发现及组成 把M期细胞的细胞质注射到卵细胞，发现可以促进卵细胞成熟分裂，继续用该卵细胞细胞质诱导新的卵细胞，仍然可以促进卵细胞成熟分裂。因而他们推测M期细胞中必然有一种物质可以诱导卵细胞成熟分裂，即促细胞成熟因子（maturation promoting factor, MPF）。
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MPF的组成： MPF是一种蛋白复合物，具有蛋白激酶活性，由两个亚单位组成，一个是细胞周期素（Cyclin），另一个是细胞周期素依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent protein kinase，CDK）。
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1.M期Cyclin-Cdk复合物（MPF）的活化
二、MPF的功能（细胞进出M期的调控） 1.M期Cyclin-Cdk复合物（MPF）的活化 随Cyclin浓度变化而变化 激酶与磷酸酶的调节 活化的MPF可使更多的MPF活化 2. MPF的失活 3.功能：启动细胞从G2期进入M期的相关事件
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MPF Cdk=M-CdK= CdK1(CDK1)=cdc2 kinase
MPF cyclin=M-cyclin=CyclinB,浓度随细胞周期变化而变化 CAK=CDK1-Activiting Kinase, ① 细胞进入G2 期，CyclinB浓度及活性升高，它与CDK1结合，使CDK1的活性位点暴露出来，此时CAK进一步磷酸化CDK1，但是由于CDK分子内尚有另外两个抑制性位点被Wee1磷酸化，使CDK1仍处于抑制状态，属于负调控。
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② 到G2 期末，磷酸酶cdc25使CDK1的两个抑制性位点去磷酸化，解除了Wee1的抑制作用，使CDK1有活性，属于正调控。
CAK cdc25 Weel
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调节性激酶和磷酸酶 Wee1使CDK Thr14和Tyr15磷酸化，遮蔽CDK激酶活性位点。 cdc25 去除Thr14和Tyr15磷酸化，恢复CDK激酶活性。
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活化的MPF能促进磷酸酶cdc25的激活，从而使更多的MPF活化，这是一个正反馈。
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MPF的失活：CyclinB的降解 ③ 到了M中期末，CDK1的激酶活性达到高峰，通过一种未知的途径，激活促后期蛋白复合体（anaphase promoting complex, APC）。
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APC是一种遍在蛋白连接酶(Ubiquitin ligase), APC使CyclinB发生遍在蛋白多聚化（泛素化），使蛋白酶体（proteosome）能识别并降解CyclinB，这种机制称为遍在蛋白化降解机制。
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M期Cyclin的N端有一段序列与其降解有关，叫降解盒。
当MPF活性最高时，通过遍在蛋白连接酶催化遍在蛋白与cyclinB结合，cyclinB随后被蛋白酶体水解。
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遍在蛋白由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名遍在蛋白。共价结合遍在蛋白的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，遍在蛋白相当于蛋白质被摧毁的标签。蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将遍在蛋白化的蛋白质分解成短肽。 APC还可以用遍在蛋白化降解机制降解连接姐妹染色单体的蛋白，促使姐妹染色单体分开，使细胞从M中期进入M后期。
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M期开始 MPF（M-CdK, CDK1）激发M期事件使细胞进入M期 M-CdK 核纤层蛋白磷酸化 组蛋白H1磷酸化 相关蛋白磷酸化
骨架和细胞器重排 核膜破裂 染色体凝集 纺锤体形成 M期开始
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M-CdK的活性下降导致细胞出M期 由于前述的遍在蛋白化降解机制，CyclinB降解， M-CdK活性下降，到M末期达到最低点，原来磷酸化的蛋白去磷酸化，从而发生了与进入M期相反的过程，细胞就走出了M期。
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2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖。
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Cyclin-Cdk复合物的多样性 Cyclin：细胞周期素，能与CDK结合，通过调节CDK的活性，间接调节细胞周期的运行。脊椎动物的Cyclin有Cyclin A（S期细胞周期素）， Cyclin B（M期细胞周期素）， Cyclin D（ G1 期细胞周期素）， Cyclin E（ G1 /S 期细胞周期素）等。 CDK：细胞周期素依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinase），通过磷酸化靶蛋白控制细胞周期中的事件，包括G1 、 G1 /S、 S和 M期CDK Cyclin-Cdk---调控细胞周期的引擎：不同的细胞周期素与不同的CDK结合，构成不同的Cyclin-Cdk复合物； 不同的Cyclin-Cdk复合物在不同的时相表现活性，影响不同的下游事件。
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细胞进出S期的调控 （一）DNA复制启动的调控
DNA的复制是由起始复制点（origins of replication）开始的，起始复制点是一种自主复制序列，散布在染色体上。在整个细胞周期中，起始复制点上结合有起始识别复合体（Origin recognition complex, ORC），其作用就象一个停泊点，供其它调节因子停靠。 Cdc6是一种调节因子，在G1期Cdc6含量瞬间提高，Cdc6结合在ORC上，在ATP供能下，促进6个亚单位构成的Mcm复合体和其他一些蛋白结合到ORC上，形成前复制复合体（pre-replicative complex，pre-RC），Mcm实际上就是DNA解旋酶。
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ORC-binding site即起始复制点
S-CdK主要通过与DNA起始复制点的pre-RC结合，启动DNA的合成。
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（二）防止DNA重复复制的调控 S-CdK触发pre-RC的启动，同时阻止了DNA再次进行复制，因为S-CdK将Cdc6磷酸化，使其脱离ORC，磷酸化的Cdc6随后被遍在蛋白化途径降解。 S-CdK的活性可持续到M早期，另外， M-CdK也能磷酸化Cdc6和Mcm，从而保证了DNA仅复制一次。
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至M末期，细胞中的M-CdK和S-CdK活性均下降到0， Cdc6和Mcm蛋白去磷酸化，重新与ORC结合形成pre-RC，细胞进入G1期，为下一周期DNA复制作准备。
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细胞周期运转的阻遏 (细胞周期运转的负调控)
细胞周期调控蛋白的种类 1.CDK CDK分子的含量在整个细胞周期中比较恒定。 CDK具有激酶活性位点，但其本身没有激酶活性。只有在与特定的cyclin分子结合后，同时其分子内某些氨基酸位点处于正确的磷酸化状态时，CDK分子才有活性。 2.细胞周期素（Cyclin）含量呈周期性变化，能与CDK结合，使CDK磷酸化和活化的蛋白，包括G1 、 G1 /S、 S和 M期细胞周期素 3.CDK抑制因子（CDK inhibitor, CKI）抑制CDK的激酶活性，阻断或延迟细胞周期的运行。
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Cdk抑制蛋白(CKI)阻止Cyclin-Cdk复合物的装配或活 性；周期调控系统组分停止合成。
◆细胞至少可通过两种不同机制阻遏细胞周期的运转： Cdk抑制蛋白(CKI)阻止Cyclin-Cdk复合物的装配或活 性；周期调控系统组分停止合成。 ◆CKI包括CIP/KIP家族和INK4家族及其它蛋白，其作用是抑制Cyclin-Cdk复合物的装配或活性，而将细胞阻止在不同的检验点。如DNA受损后，细胞将停留于G1 Checkpoint 让DNA修复或者凋亡。CKI如p21, p15, p16,p27等。 ◆周期调控系统组分停止合成，如G0细胞，大部分Cyclin和Cdk都消失，这在多细胞生物尤其明显。
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发生在G1期的细胞周期调控事件 G1期Cdk活性较低的原因：
1.CKI作为细胞周期的抑制因子直接与CDK或Cdk蛋白复合体结合，抑制Cdks的活性。 2.由于Cyclin转录活性下降，引起Cdks活性下降。 Cdks活性下降的意义： 可防止细胞在G1期启动DNA复制和细胞分裂等事件，保证细胞有足够时间完成G1期的事件。
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G1期Cyclin和CDK的激活 细胞在激素或生长因子的刺激下，G1期Cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使CDK4和CDK6的活性升高，进而激起G1 /S-CdK和S-CdK蛋白复合体的活性升高，从而启动了DNA合成，使细胞从G1期进入S期。
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细胞周期检验点(限制点checkpoint)
◆细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制, 主要是确保周期每一时相事件的有序、全部完 成并与外界环境因素相联系 ◆细胞周期检验点及其作用
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细胞周期的检验点有四个： DNA损伤限制点（ G1/S检验点）:在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？ DNA 复制限制点（S期检验点）：DNA复制是否完成？ DNA复制如果没完成，则细胞不能进入M期。 G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？ 纺锤体连接限制点（中-后期检验点）：任何一个染色体动粒没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。
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细胞周期中的信号系统调控 细胞周期过程受内外环境因素调节，生长因子或激素，可以作为信号分子与细胞内受体结合，通过信号传递系统将调控信息传递并影响细胞核内相关转录因子和细胞周期调控蛋白，从而影响细胞周期。 生长因子：如表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）等，有一定的组织和细胞特异性。 激素：分蛋白类激素和固醇类激素，前者受体位于靶细胞膜，后者受体位于靶细胞质内。
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