第二章 天然药物化学成分的提取分离与鉴定 主讲－吴方评

第一节 有效成分的提取与分离 一、有效成分的提取 （一）溶剂提取法 溶剂提取法 溶 解 规 律 提 取 方 法 溶 剂 类 型

（二）水蒸气蒸馏法 适用范围：水蒸气蒸馏是分离和纯化与水不相混溶的挥发性有机物常用的方法。

（三）升华法 适用于有升华性质的成分。 升华法提取咖啡因

二、有效成分的分离和精致 （一）系统溶剂分离法 （二）两相溶剂萃取法 原理： （三）沉淀法 （四）吸附法 （五）盐析法 （六）透析法

第二节 结晶和重结晶 结晶与 重结晶

第三节 天然药物化学成分色谱分离法

复习

一、溶剂提取法 1.浸渍法 2.渗漉法 3.煎煮法 4.回流提取法 5.连续回流提取法 6.超声提取法 7.微波辅助提取法

二、水蒸气蒸馏法 应用：具有挥发性、难溶或不溶于水、与水不反应的化合物。 装置：

提取 分离

色谱分离法 Chromatography 基本原理：利用混合物中的各组分在固定相中作用力的差异，从而使混合物中的各组分达到分离。

色谱（chromatography） 固定相 LC 构成 液体 流动相 GC 气体

一、吸附色谱法 原理：是利用吸附剂对混合物中的各种组分的吸附能力不同而使各成分达到分离的方法。

吸附色谱的三要素 吸附剂 三要素 洗脱剂 被分离的物质

（一）吸附剂 1.硅胶 SiO2·xH2O 结构

1.粒度 2.孔径 硅胶的吸附效率 3.表面积

1.硅胶G（含煅石膏） 2.硅胶H 硅胶类别 3.硅胶S（含淀粉） 4.硅胶F（含荧光物质）

硅胶的使用 B.用量 样品：硅胶 1：30～60 较难分离的样品 1：500～1000 A.适用范围 适用于中性和酸性成分的分离。 为什么？

2.氧化铝

1.氧化铝G 2.氧化铝H 类型 3.氧化铝HF254 4.氧化铝GF254

色谱氧化铝的使用 A.适用范围 适用于中性和碱性(生物碱)成分的分离。 为什么不能用来分离酸性化合物？ B.用量 样品：氧化铝 1：20～50 较难分离的样品 1：100～200

3.活性炭 活性炭分类及特点 1.粉末状活性炭 特点：颗粒细、比表面积大、吸附力大。流速慢、需加压或减压操作。 2.颗粒状活性炭 特点：颗粒适中、比表面积较大、流速较快、易于控制。 3.锦纶活性炭 特点：比表面积介于上面两者之间，吸附能力比上面两者小。

使用 1.适用范围 分离氨基酸、糖类和苷类等水溶性成分 2.操作方式 柱色谱

（二）洗脱剂 柱色谱 流动相 洗脱剂 薄层色谱 展开剂

洗脱剂的选择 综合考虑被分离物质的极性和吸附剂的极性 1.被分离物质→极性强→弱活性吸附剂→强极性洗脱剂 2.被分离物质→极性弱→强活性吸附剂→弱极性洗脱剂 单一溶剂：分离重现性好，组成简单。 多元溶剂：分离效果好。

被分离的物质 1.极性吸附剂 被分离化合物的极性基团极性越大、数量越多吸附力越强，共轭双键越多吸附力越强。 2.非极性吸附剂 极性越小吸附力越强。

（四）操作方式 1.薄层色谱（thin layer chromatography） 操作步骤：制板→点样→展开→显色 2.柱色谱（column chromatography） 操作步骤：装柱→上样→洗脱

中药柱层析设备

二、分配色谱法 基本原理：利用混合物中的各种成分在互不相溶的两相溶剂中的分配系数不同而将混合物中的组分分离的一种色谱方法。

几个重要的概念 支持剂 固定相 流动相 流动相 药物分子A 药物分子B

特点：极性越大流出越慢，极性越小流出越快。 （一）正相分配色谱 支持剂（如硅胶） 固定相（如水） 流动相（如氯仿） 特点：极性越大流出越慢，极性越小流出越快。

特点：极性越大流出越快，极性越小流出越慢。 （二）反相分配色谱 支持剂（如C18键合硅胶） 固定相（如石蜡油） 流动相（如水） 特点：极性越大流出越快，极性越小流出越慢。

（三）操作方式 1.纸色谱（paper chromatography,PC） 2.分配薄层色谱 3.分配柱色谱 注意：流动相必须用固定相饱和，否则固定相会慢慢流失，影响分离效果。

三、聚酰胺色谱法 聚酰胺的结构

原理：氢键缔合原理。 缔合原理示意图

（一）流动相 1.形成氢键倾向 在水中聚酰胺与化合物形成氢键的能力较强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。 2.流动相洗脱能力 尿素水溶液﹥二甲基甲酰胺﹥甲酰胺﹥稀氢氧化钠溶液或稀氨水﹥丙酮﹥乙醇﹥水

（二）聚酰胺与化合物分子结构的关系 1.化合物分子中形成氢键的基团越多被吸附倾向越强

2.形成氢键的基团所处位置不同，被吸附的强度不同

3.分子芳香化程度越高，被吸附越强 4.形成分子内氢键，吸附强度减弱

（三）操作方式 装柱 聚酰胺柱色谱 上样 洗脱

小结： 色谱方法 原理 操作方式 吸附色谱 作用力不同 薄层色谱、柱色谱 分配色谱 分配系数不同 纸色谱、薄层色谱、柱色谱 聚酰胺色谱 氢键作用 柱色谱

本节课练习 1. 化合物进行反相分配柱色谱时的结果是（ ） A. 极性大的先流出 B. 极性小的先流出 1. 化合物进行反相分配柱色谱时的结果是（ ） A. 极性大的先流出 B. 极性小的先流出 C. 熔点低的先流出 D. 熔点高的先流出 2.基本母核相同的化合物，被氧化铝吸附最牢的是（ ） A.R-COOH B.R-CHO C. R-OH D-CH3 E.R-NH2

3.聚酰胺与下列化合物形成氢键能力最强的是（ ）

四、离子交换色谱法 离子交换色谱法 原理 操作 装 柱 上 样 洗 脱

五、大孔吸附树脂法

六、凝胶色谱法 1.分类 2.分离原理 3.应用 七、高效液相色谱法 八、气相色谱法 岛津GC2010

第四节 天然药物化学成分结构测定 一、结构测定的主要程序

结构测定的程序 人工合成进行确认 波谱、化学方法 推测出结构式 分子量分子式的确定 推测母体结构类型 功能基情况 纯度鉴定

纯度确定--最基本的条件 检查纯度的方法：  外观、颜色、形态是否均一；  测定各种物理常数，如熔点、沸点、比旋光度、折光率等，这些物理常数都反映了化合物的纯度。  如果可能是已知物，用已知结构的对照品进行对照测定或测定它们的共熔点等；  也可对照文献报导值（注意各种测定条件的一致性）  薄层层析（三种展开系统和三种显色方法）  高效液相层析；

化学方法—辅助手段 ● 某些成分或功能基，可以和一些特定试剂产生各种颜色或沉淀，有助于判断化合物类型和功能基：  生物碱类大都能和生物碱沉淀试剂产生沉淀；  羟基葸醌类遇碱呈红色；  盐酸一镁粉试剂能和许多黄酮类化合物呈色。

● 鉴别功能基的化学反应： 三氯化铁反应、三氯化铝反应等等。 利用在酸水或碱水中的溶解度情况，提示该化合物碱性功能基或酸性功能基的存在以及有无内酯、内酰胺结构。

● 化学降解法  将复杂分子通过氧化、还原等化学反应，降解为几个结构比较简单又稳定的小分子化合物，通过对降解产物的结构鉴定，再按降解机理合理地推导出原来可能的化学结构式。

化学降解法 ● 特点： ● 衍生物制备－用化学方法研究结构的一种常用手段，对结构推定有一定意义。 ● 特点：  需用化合物量大；  反应剧烈；  主要产物得率少又费时； 现在较少应用，仅保留一些比较简单规律性又较强的降解反应 ● 衍生物制备－用化学方法研究结构的一种常用手段，对结构推定有一定意义。

UV IR MS NMR 四大光谱 波谱方法—主要手段

光谱 紫外光谱 用波长在200～400nm之间的连续光扫描记录下来的图谱，吸收带比较宽； 红外光谱 用波长在800nm～20μm之间的连续光扫描记录下来的图谱，谱线比较尖锐；

岛津 2450/2550PC 光谱仪器 傅立叶变换红外光谱仪

核 磁 共 振 仪 质 谱 仪

紫外光谱(Ultra-Violet, UV) 测定范围：波数200～400nm 之间 作用：  提供基本骨架信息;  样品中杂质的测定  定量分析 特点：  液态样品才能测定；  常规紫外光谱仪价格低廉；  样品用量少（只需5-10 μg）

紫外光谱(Ultra-Violet, UV) 生色团 产生紫外吸收的不饱和基团，如C=C, C=O, O=N=O等； 助色团：其本身是饱和基团（常含有杂原子），它连到生色团上时，能使后者吸收波长变长或吸收强度增加，如-OH, -NH2, -Cl等； 深色位移：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变长，也叫红移（red shift）； 浅色位移：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变短，也叫蓝移（blue shift）；

具有相同基本骨架化合物的UV光谱相同，但并非是同一化合物；

红外光谱(Infra-Red, IR) 测定范围 波数600～4000cm -1之间，其中1600cm-1以上为化合物的特征基团区，1000-500cm-1为指纹区。 作用 主要用于定性分析，功能基的确认，芳环取代类型的判断等。 优点：  任何气态、液态、固态样品均可测定；  每种化合物都有红外吸收；  常规红外光谱仪价格低廉；  样品用量少（只需5-10 μg）

特征基团区 指纹区 三要素：位置、强度、峰形

-C-O- -OH CH3OH

C=O

● 如果被测定物是已知物，只要和已知对照品做一张共红外光谱图，二者红外光谱完全一致则为同一物质； ● 如无对照品也可检索有关红外光谱数据图谱文献。

(Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 核磁共振谱 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) ● 1945年，F. Bloch和E. M. Purcell 几乎同时发现了核磁共振现象，获得1952年诺贝尔物理奖。 ● 核磁共振仪器的发展： 40 60  90  100  300  500  600  750 MHz ●核磁共振： ●天然药物化学成分以有机物为主，分子结构中必然有C、H原子，它们的结合类型、化学环境不同，均可用NMR测定，是天然化合物结构测定的重要手段。 氢核磁共振（1H-NMR)谱 碳核磁共振（13C-NMR)谱

● 氢核磁共振（1H-NMR)谱： ●碳核磁共振（13C-NMR)谱：  化学位移范围：在0-20 ppm  三大要素：化学位移(ppm)、偶合常数(J)及峰面积。  灵敏度高，样品用量少（1-5 mg），测试时间短 ●碳核磁共振（13C-NMR)谱：  化学位移范围：在0～250 ppm  要素：化学位移(ppm) 灵敏度较低，样品用量较多（5～20 mg），测试时间长

C=C 溶剂 C=O CH2 C=C-O

DEPT-135

适用范围：信号过于复杂、重叠严重时，而对结构推断产生困难时，可以简化谱图，有助判断； 二维核磁共振谱 适用范围：信号过于复杂、重叠严重时，而对结构推断产生困难时，可以简化谱图，有助判断； 特点：  对测试仪器要求比较高（超导核磁共振仪）；  谱图测试价格比较贵；  测试时间长，样品用量比较多（只需5～20 mg）

NOESY

HMQC

质谱（MS） 作用：  用于确定分子量； 特点：  提供其他的结构信息；  常规质谱仪价格比较便宜，一些特殊质谱仪很昂贵；  求算分子式；  提供其他的结构信息； 特点：  适宜测定极性偏小和中等极性的化合物；  常规质谱仪价格比较便宜，一些特殊质谱仪很昂贵；  样品用量少（只需5-10 μg）

ESI-MS 1219.7 [M-H]- 1243.8 [M+Na]+ MW=1218, C58H94O27

How to learn ? 植物来源  结构特点  理化性质  提取分离 结构测定  生物活性 对每一个具体的结构类型：要掌握下面的主线 植物来源  结构特点  理化性质  提取分离 结构测定  生物活性  在理解的基础上，用自己的语言来消化和记忆，善于归纳和总结，做到触类旁通，举一反三。 

小结 一、提取方法与技术 1.溶剂提取率（原理、溶剂、方法） 2.水蒸气蒸馏法 二、分离方法与技术 1.系统溶剂分离法 2.萃取法 3.沉淀法 4.结晶法 三、色谱分离法 1.吸附色谱 2.分配色谱 四、结构测定

作业布置 1.溶剂提取法中溶剂的选择原理是什么？ 2.结晶法德原理是什么？ 3.吸附色谱法的原理是什么？

参考文献 《天然药物化学》，科学出版社，主编：杨宏建，2009。 《天然药物化学》，河南科技出版社，主编：杨宏建，2007。 《天然药物化学》，人民卫生出版社，主编：吴立军，2006版。