第六章 非水相生物催化

1984年，克立巴诺夫等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功的利用酶在有机介质中的催化作用，获得了酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物。 明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应；也可以在水和有机溶剂组成的双液相体系中进行催化反应；还可以在只含有微量水的有机溶剂，又称微水介质中进行催化反应。

主要内容 一、酶催化反应的介质 二、有机介质反应体系 三、酶在有机介质中的催化特性 四、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 Go 一、酶催化反应的介质 Go 二、有机介质反应体系 Go 三、酶在有机介质中的催化特性 Go 四、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 Go 五、酶非水相催化的应用

一 酶催化反应的介质 但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物在水介质中难溶或不溶。 水是酶促反应最常用的反应介质。 但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物在水介质中难溶或不溶。 由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。

酶非水相催化的类型 有机介质中的酶催化 是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。 酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。

气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的催化反应。

超临界介质中的酶催化 是指酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。用于酶催化反应的超临界流体应当对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响；具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；超临界流体要容易获得，价格要便宜等。

离子液介质中的酶催化 离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类， 挥发性低、稳定性好。 酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。

1914年合成出现最早的室温离子液体硝酸乙基铵。 2003年，在邓友全教授的带领下，中科院兰州物理研究所成功地使用离子液体作为催化体系，用二氧化碳取代剧毒的光气（COCl2）和一氧化碳等应用于异氰氰酸酯中间体的合成。 2005年，我国中科院过程工程研究所自主成功开发了离子液体规模化制备设备和清洁技术工艺，解决了小规模制备原料成本高、合成过程复杂、溶剂和原料循环利用差、污染严重、转化率低等问题。

二 有机介质反应体系 1、非极性有机溶剂——酶悬浮体系(微水介质体系) 用非极性有机溶剂取代大量的水，使固体酶悬浮在有机相中。 但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。 酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。

2、与水互溶的有机溶剂水单相体系 有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。 3、非极性有机溶剂水两相 由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。

4、正胶束体系 5、反胶束体系

底物 产物 界面 有机溶剂 酶 有机溶剂 酶

反应体系中水对酶催化反应的影响 酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。 有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。

必需水（essential water）：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量。 最适含水量：使酶具有最大催化反应速率的含水量。

反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响 常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。 在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别。

极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。 有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。

三 酶在有机介质中的催化特性 底物特异性 立体选择性 区域选择性 键选择性 热稳定性

“钢性”与”柔性”的动态平衡

在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。

四 有机介质中酶促反应的优点 有利于疏水性底物的反应； 可提高酶的热稳定性；

表1 某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性 酶 介质条件 热稳定性 猪胰脂肪酶 三丁酸甘油酯 水， pH7.0 T1/2 < 26 h 表1 某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性 酶 介质条件 热稳定性 猪胰脂肪酶 三丁酸甘油酯 水， pH7.0 T1/2 < 26 h T1/2 < 2 min 酵母脂肪酶 三丁酸甘油酯/庚醇 水，pH7.0 T1/2 =1.5 h 脂蛋白脂肪酶 甲苯，90℃，400 h 活力剩余40％ 胰凝乳蛋白酶 正辛烷，100℃ 水，pH 8.0, 55℃ T1/2 = 80 min T1/2 = 15 min 枯草杆菌蛋白酶 正辛烷，110℃ 核糖核酸酶 壬烷，110℃，6 h 水，pH 8.0, 90℃ 活力剩余95％ T1/2 < 10 min 酸性磷酸酶 正十六烷，80℃ 水，70℃ T1/2 = 8 min T1/2 = 1 min 腺苷三磷酸酶 ( F1-ATPase) 甲苯，70℃ 水， 60℃ T1/2 > 24 h 限制性核酸内切酶 （Hind Ⅲ） 正庚烷，55℃，30d 活力不降低 β-葡萄糖苷酶 2-丙醇，50℃，30 h 活力剩余80％ 溶菌酶 环己烷，110℃ 水 T1/2 =140 min T1/2 = 10 min

能催化在水中不能进行的反应； 如脂肪酶催化肌醇烟酸酯的合成。 可改变反应平衡移动的方向。

表2 某些酶在有机介质中的催化效率 酶 合成产物 有机溶剂 使用浓度（%） 合成收率（%） 枯草杆菌蛋白酶 核糖核酸酶 甘油 90 50 表2 某些酶在有机介质中的催化效率 酶 合成产物 有机溶剂 使用浓度（%） 合成收率（%） 枯草杆菌蛋白酶 核糖核酸酶 甘油 90 50 无色杆菌蛋白酶 人胰岛素 DMF（二甲基甲酰胺 ）和乙醇 30 80 羧肽酶 牛胰核糖核酸酶 凝血酶 人生长激素 20

可控制底物专一性 不同的有机溶剂极性不同，对底物的结合能力也不同。 在极性较强的介质中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的介质中，疏水性较弱的底物容易反应。

可防止由水引起的副反应； 可扩大反应的pH值适应性; 在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH相同，这种现象称为pH印迹（pH imprionting）或pH记忆。

酶易于实现固定化; 酶和产物易于回收; 可避免微生物污染。

五 有机介质中酶催化反应的条件及其控制 （1）酶在有机介质中催化反应的类型： 合成反应； 转移反应； 醇解反应； 氨解反应； 异构反应； 氧化还原反应； 裂合反应等。

主要应控制的条件有: 酶的种类和浓度 底物的种类和浓度 有机溶剂的种类 水含量 温度 pH 离子强度

a)酶的选择 酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶，过氧化物酶等。 不同的酶具有不同的结构和特性，同一种酶由于来源的不同和处理方法（如纯度、冻干条件、固定化载体和固定化方法、修饰方法和修饰剂等）的不同，其特性也不同。 对酶的选择既要看催化反应速度的大小，还要看酶的稳定性、底物专一性、立体异构选择性、区域选择性和键选择性。

b)底物的选择和浓度控制 要根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物。 底物的浓度对催化反应的速度有显著的影响。

c)有机溶剂的选择 水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等 水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等

有机溶剂的极性选择要适当。 极性过强的溶剂，会夺取较多的酶分子表面的结合水，影响酶分子的结构；并使疏水性底物的溶解度降低，从而降低酶促反应的速度。 极性过弱的溶剂，疏水性底物在其中溶解度较高，但底物难于进入酶分子的必需水层，催化反应的速度不高。

选择有机溶剂必须考虑因素： ①有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）。包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。 如：酶促糖改性，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）

②溶剂必须对于该主反应是惰性的 如：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。

③溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等。 ④溶剂参数（lgP）：是一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。

有机溶剂能渗透入酶的活性中心 酶在有机介质中催化时其底物的km值会比在水里时显著增大 降低活性中心的极性，从而增加酶与底物的静电斥力，因而降低了底物的结合能力 有机溶剂能渗透入酶的活性中心 作为底物的竞争性抑制剂与底物分子竞争在酶活性中心的接合点 溶剂极性越弱，这一效应可能越强

d)水含量的控制 把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。正因如此，才能使用有机介质代替水溶液，进行酶促反应。 与酶分子起作用的只是与酶分子紧密接触的一层束缚水，只要保证这些基本必需的水分子固定在酶分子表面，而水溶液中其他大部分的自由水尽可以被有机溶剂所代替。

必需水： 紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量的水称为必需水（或结合水、束缚水）。

有研究表明：在不同极性有机溶剂的低水反应介质中，随着溶剂的亲水性增大，保持在糜蛋白酶表面的束缚水下降2. 5％～1 有研究表明：在不同极性有机溶剂的低水反应介质中，随着溶剂的亲水性增大，保持在糜蛋白酶表面的束缚水下降2.5％～1.0％，而酶活性随之下降了10000倍。酶在完全干燥的溶剂中通常没有活性。所以体系中有足够的水分对酶的催化起着重要的作用。

在特定的有机介质反应体系中，催化速度达到最大时的含水量称为最适含水量。 酶活性 含水量 最适含水量 动力学刚性 热力学不稳定

影响酶反应体系中需水量的因素 酶 有机溶剂的类型

“刚柔并济” 过多水分子 构象变化 酶活性部位形成水簇 产生介电屏蔽 降低蛋白质分子带电氨基酸和极性氨基酸之间的相互作用 产生传质阻力 酶聚集成团 疏水底物较难进入酶的活性部位 酶分子的构象刚性过强 含水量低于最适含水量 构象变化 酶分子的构象柔性过大 含水量高于最适含水量

a．不同酶需水量不同 b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同。 溶剂疏水性越强，需水量越少

胰脂肪酶活性与含水量的关系 反应速度

e)温度的控制 在微水有机介质中，由于水含量较低，酶的热稳定性增强，所以其最适温度高于其水溶液中的最适温度。 随温度升高，酶的立体选择性降低。

f) pH的控制 在有机介质中，酶的催化活性与其在缓冲液中的pH值和离子强度密切相关。

六 酶非水相催化的应用 酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶类； 过氧化物酶、过氧化氢酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、多细胞色素氧化酶等氧化还原酶类；醛缩酶等酶类中的十几种酶在适宜的有机溶剂中具有与水溶液中可比的催化活性。

表3 常用的有机介质中的生物催化剂 蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类酰基化 羟基化酶 氧化 甾体转化 表3 常用的有机介质中的生物催化剂 酶 催化反应 应 用 蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类酰基化 羟基化酶 氧化 甾体转化 过氧化物酶 聚合 酚类、胺类化合物的聚合 多酚氧化酶 氧化 芳香化合物的羟基化 胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定 醇脱氢酶 酯化 有机硅醇的酯化

（1）有机介质中脂肪酶催化的酯化反应 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，研究表明，在水溶液中它催化油脂和其它脂类的水解反应，而在有机介质中它可催化水解反应的逆反应——酯交换和酯合成反应，目前被广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。 不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。

酶 催化反应 应用 脂肪酶 肽合成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 转酯 各类酯类生产 聚合 二酯的选择性聚合 酶 催化反应 应用 脂肪酶 肽合成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 转酯 各类酯类生产 聚合 二酯的选择性聚合 酰基化 甘醇的酰基化

位置选择性酯化反应 葡萄糖苷-6-O-酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂，它可以用脂肪酸和葡萄糖在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到：

消旋化合物选择性酯化 以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸为原料，在有机溶剂介质中用酵母菌脂肪酶(CCL)或猪肝酯酶（PLE）催化酯化反应，可得到较高光学纯度的R-或S-酯。

消旋化合物的拆分 有机介质中用假丝单孢菌脂肪酶(PSL)催化酯化用于γ-羟基-α,β-不饱和酯的拆分。可以避免副反应的发生。

内酯合成反应 -羟基酸或它的酯在脂肪酶催化下，发生分子内环化作用得到内酯化合物。内酯可继续反应形成开链寡聚物。 内酯化产物形式主要取决于羟基酸的长度外，也取决于脂肪酶的类型、溶剂及温度等。

脂肪酶—— 乙酸已酯：浓香型白酒的主香 L-抗坏血酸棕榈酸酯/硬脂酸酯 肌醇烟酸酯

（2）生物柴油（biodisel）的生产 生物柴油(Biodiesel)是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。 废弃的地沟油

动物油脂 工业废油

生物柴油的生产方法 化学法：采用酸、碱催化油脂与甲醇之间的转酯反应，而生成脂肪酸甲酯。反应时间短，成本低。但在反应过程中使用过量的甲醇，而使后处理过程变得较为繁杂。能耗高；色泽深，在高温下容易变质；酯化产物难于回收；生产过程有废碱液排放 生物酶法：在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子醇类的酯交换反应，生成小分子的酯类混合物。条件温和，醇用量小、无污染排放。缺点：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%～60%，酶的使用寿命短。副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。 本章 目录

优点： （1） 具有良好的环境属性 （2） 具有较好的低温发动机启动性能。 （3） 具有较好的润滑性能。 （4） 具有较好的安全性能。 （5） 具有良好的燃料性能。 （6） 具有可再生性能。

生物柴油的应用 柴油的应用特点： 燃烧不完全，对空气污染严重。 如产生大量的颗粒粉尘，CO2、氮氧化物和硫化物等排放量高。 这就是黑烟 浓烟滚滚的卡车

生物油脂的来源：菜子油，豆油，椰子油，棕榈油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽油，废食用油等。 生物柴油生产装备 从生物质到生物柴油

美国生物柴油发展趋势

（3）酶非水相催化的其它应用 手性药物的拆分 手性高分子聚合物的制备 酚树脂的合成 导电有机聚合物的合成 发光有机聚合物的合成 食品添加剂的生产 多肽的合成 甾体转化

手性药物两种对映体的药效差异 一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效 一种有显著疗效，另一种有毒副作用 两种对映体的药效相反 两种对映体具有各自不同的药效 两种消旋体的作用具有互补性

手性药物两种对映体的药理作用 药物名称 有效对映体的作用 另一种对映体的作用 普萘洛尔 萘普生 青霉素胺 羟基苯哌嗪 反应停 酮基布洛芬 喘速宁 乙胺丁醇 萘必洛尔 S构型，治疗心脏病,β-受体阻断剂 S构型，消炎、解热、镇痛 S构型，抗关节炎 S构型，镇咳 S构型，镇静剂 S构型，消炎 S构型，扩张支气管 S构型，抗结核病 右旋体，治疗高血压,β-受体阻断剂 R构型，钠通道阻滞剂 R构型，疗效很弱 R构型，突变剂 R构型，有神经毒性 R构型，致畸胎 R构型，防治牙周病 R构型，抑制血小板凝集 R,R构型，致失明 左旋体，舒张血管

手性药物的拆分 分为：非生物法、生物法 非生物法（机械分离法、 形成和分离对映体异构法、 色谱分离法、 动力学拆分） 生物法的原理：两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性。

快：E+A→E+P 慢：E+B→E+Q 对映体选择率：底物中一对异构体（同一个酶的两种竞争性底物）的Vm/Km之比为酶的选择性。

导电有机聚合物的合成 辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。 主要用于传感器、电池和电容器等的制备。

传感器 传感器是一种检测装置，能感受到被测量的信息，并能将检测感受到的信息，按一定规律变换成为电信号或其他所需形式的信息输出，以满足信息的传输、处理、存储、显示、记录和控制等要求。 它是实现自动检测和自动控制的首要环节。

化学传感器（chemical sensor）：对各种化学物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。对比于人的感觉器官，化学传感器大体对应于人的嗅觉和味觉器官（见图）。但并不是单纯的人器官的模拟，还能感受人的器官不能感受的某些物质，如H2、CO2。 物理传感器（physical sensor）是检测物理量的传感器。它是利用某些物理效应，把被测量的物理量转化成为便于处理的能量形式的信号的装置。其输出的信号和输入的信号有确定的关系。主要的物理传感器有光电式传感器、压电传感器、压阻式传感器、电磁式传感器、热电式传感器、光导纤维传感器等。

24GHz的雷达传感器 是一种可以将微波回波信号转换为一种电信号的转换装置，是雷达测速仪，水位计，汽车ACC辅助巡航系统，自动门感应器等的核心芯片。

发光有机聚合物的合成 辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，可以发出蓝光。

食品添加剂的生产 4-羟基-3-甲氧基苯甲醛

尼泊金十二酯 尼泊金酯类是国际上公认的广谱、高效、安全的食品防腐剂之一，在食品工业中有广泛应用。 同其它与几种传统上经常应用的食品防腐剂相比，尼泊金酯类具有以下几点优势：第一，抑菌效果好，抑菌谱广，因而在食品中添加量小，且应用范围广；第二，应用的这pH值范围大，有些防腐剂只有在酸性条件下才有明显的抑菌作用，而尼泊金酯类在pH值4~8范围内均有很好的抑菌效果；第三，毒副作用小。且研究表明，尼泊金酯类的抑菌能力随着酯基碳原子数的增加而增大，毒副作用则减小，这为人们开发新型尼泊金酯类防腐剂指明了方向。

多肽的合成 a-胰蛋白酶可以催化N- 乙酰色氨酸与亮氨酸合成二肽； 水中反应合成率为0.1%以下； 在乙酸乙酯和微量水组成的系统中，合成率可达100%。

甾体转化 可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成的系统中，转化率高达100%和90%。 氢化可的松

练习题 1、酶的非水相催化主要包括哪几种类型？其中酶的有机介质反应体系主要有什么？ 2、简述有机介质中酶促反应的优点。 3、有机介质反应中的必需水和最适含水量。 4、有机介质中酶催化反应需要控制的条件主要有哪些？ 5、进行有机溶剂选择时主要考虑哪些因素？ 6、酶的非水相催化主要有哪些方面的应用？（论述）