实验二 1、观察上次课实验结果 2、革兰氏染色法(Gram’s stain) 3、细菌的基本形态观察 4、细菌的特殊构造观察 5、抗酸染色（Acid-fast stain) 6、破伤风外毒素试验、内毒素毒力 试验

观察上次课实验结果 自然界细菌的分布 1、水中细菌的检查 2、空气中细菌的检查 3、手指细菌的检查 4、口腔中细菌的检查 平板分离培养法 斜面培养基接种法 液体培养基接种法 半固体(高层)培养基接种法 细菌生化反应

喷嚏中的细菌

平板分离培养法 结果观察:主要观察菌落特征 大小：用直径(mm)表示。一般直径1mm左右的为小菌 落；直径2~3mm的为中等大小菌落；直径3mm以上的为 大菌落。 形状：圆形、卵圆形及不规则形等。 边缘：整齐、锯齿状、毛发状等。 表面：光滑、皱纹、湿润、干燥等。 隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。 颜色：无色、白色、黄色、柠檬色等。 透明度：透明、不透明、半透明等。 结构：均质性、颗粒状等。 溶血性：不溶血、草绿色溶血环、透明溶血环。

观察菌落时，不要将从空气中落入培养基而生长的杂菌误认为目的细菌。杂菌一般生长于划线痕迹以外，或为形状异常的个别孤立菌落。为避免上述情况发生，在接种时，应避免空气中的杂菌落人培养基。 目前临床检验常使用全自动培养仪，大大提高了培养的效率和质量。如全自动快速血培养仪(BactAlertl20)能从血液和体液中快速检出需氧菌、厌氧菌、L型细菌和真菌，一般24h内检出率达85％，48h内检出率达95％以上。

平板划线法

菌落：在固体培养基上形成的， 肉眼可见的，具有一定形态 结构的子细胞群体 不同的菌落在大小、形状、 光泽度、颜色、硬度、透明度 等方面具有一定的特征。 ---------（可作为菌种鉴定的依 据）

固体培养基：菌落，菌苔

大肠杆菌平板菌落

斜面培养基接种法 实验结果 细菌生长为均匀一致的菌苔,为纯种。若有孤立菌落出现，则可能是接种时受到污染。

液体培养基接种法 实验结果 细菌在液体培养基中生长有三种形式：混浊生长(如大肠杆菌)；沉淀生长(如乙型溶血性链球菌)；菌膜生长(如枯草杆菌)。

液体培养基：表面生长 均匀混浊生长 沉淀生长

半固体(高层)培养基接种法 实验结果 无鞭毛的细菌培养后，仅沿穿刺线生长，穿刺线增粗，培养基清亮；有鞭毛的细菌，沿穿刺线向周围生长，穿刺线模糊不清，培养基混浊。

半固体培养基： 无动力 有动力

细菌生化反应结果观察 糖发酵： 细菌如分解糖时，则产酸，使指示剂变色(一般记录符号是“+”)；有些细菌在分解糖的同时还产生气体，则倒立小管中有气泡出现(记录符号为“⊕”)；如细菌不分解该糖时，指示剂不变色，不见培养液混浊(记录符号为“-”)。

葡萄糖 HCOOH 脱氢酶 CO2+H2

靛基质试验 取出后滴加数滴靛基质指示剂于培养基的液面上，接触面上形成玫瑰红色看为阳性，仍呈黄色者为阴性。若颜色不明显，可再加4~5滴乙醚，振荡试管使乙醚分散于液体中，若培养液中有靛基质存在，就可被提取至乙醚层中，颜色较为明显。

I-吲哚（indol）试验 色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚 ↑ 吲哚试剂 - +

硫化氢产生试验 乙型副伤寒杆菌、变形杆菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢， 使培养基变成黑褐色。 +（FeS黑色）

尿素酶试验 尿素分解试验 变形杆菌能迅速(2～4h)分解尿素而产生大量的氨，使培养基呈碱性而变成紫红色，视为阳性反应。

I M Vi C试验 大肠埃希菌 + + - - 产气杆菌 - - + +

上层为固体乳糖 下层为半固体葡萄糖 双糖含铁培养基

革兰氏染色法(Gram’s stain) 实验目的： 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法的 操作技术，理解其在鉴别细菌上的意义。

实验原理 (1)细胞壁结构的差异。G+菌细胞壁肽聚糖层数多，且肽 聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致 密，结晶紫—腆复合物不易从细胞内漏出，仍为紫蓝色。 而G-菌细胞壁较为疏松，肽聚糖层很薄，且为平面结 构，外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被乙醇溶 解，使细胞壁通透性增高，结晶紫—碘复合物容易漏出， 使细菌被脱色，再经石炭酸复红染成红色。 (2) G+菌含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫—碘结合成 更大分子复合物，不易脱色；而G-菌中此种物质含量甚 少，故易于脱色。 (3) G+菌等电点(pH约为2-3)比G-菌等电点(pH约为4-5) 低，在同样的pH染色环境中， G+菌所带的阴电荷比G-菌 多，故与带阳电荷的结晶紫染料结合较为牢固，不易脱 色。

实验材料 (1)葡萄球菌与大肠杆菌24h斜面培养物或肉汤培养物。 (2)革兰氏染色液包括结晶紫染液；卢戈氏碘液；乙醇(体积分数为95％)；稀释的石炭酸复红。 (3)生理盐水、载玻片、接种环等。

实验方法 (一)涂片标本的制作 (1)涂片。先将接种环火焰灭菌，稍冷却后取菌液一滴，于载玻片上涂一层均匀的膜，直径约1 cm。如用斜面培养物作涂片时，应先取一滴生理盐水，滴于玻片中央，再取少量纯菌，混于盐水中，然后再涂片。 (2)干燥。置于空气中自然干燥，或置于火焰上方略加烘烤，使液体干燥。 (3)固定。将玻片(菌膜面朝上)从火焰中部反复通过3次，使细菌固着于载玻片上并杀死大部分细菌。

(二)染色 (1)初染。吸取结晶紫染液滴于涂膜上，染色1min，水洗。 (2)媒染。加卢戈氏碘液媒染1min，水洗。 (3)脱色。用体积分数为95％的乙醇脱色，脱色时轻轻摇动玻片，直到涂膜上的染色不再脱落为止，约20～30s，迅速水洗。 (4)复染。滴加稀释的石炭酸复红染0．5～1min，水洗。 (三)观察 干燥后(或用吸水纸吸干水分)，油镜下观察。 实验结果： 染成紫蓝色的为C+菌。染成红色的为C-菌。

革兰染色操作步骤

注意事项 ： 1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3．酒精脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。另外，脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般做到取菌要少，涂膜薄而均匀为好。 4．被检菌的菌龄一般最好在18～24h之内，因为被检菌的培养条件、营养成分、菌龄的不同会影响染色结果，如C+菌的陈旧培养物也可出现革兰氏染色阴性结果。

大肠杆菌革兰氏染色

染色显示革兰氏阴性阳性细菌

细菌的基本形态观察

细菌的特殊构造观察

土壤中分离的荧光假单胞菌

白喉杆菌异染颗粒

抗酸染色（Acid-fast stain) 目的： 1、掌握抗酸染色法。 2、掌握结核杆菌的形态、染色特点。 原理： 抗酸性细菌如结核杆菌等，细胞壁中含有丰富的脂类，其中分枝菌酸与石炭酸复红结合成牢固的复合物，能抵抗3％盐酸酒精的脱色作用，而使菌体保持红色，故称抗酸染色法。

材料：肺结核患者痰液，抗酸染色液（石炭酸复红、3％盐酸酒精、碱性美蓝），载玻片，酒精灯，等。 方法： 1、涂片：用接种环挑取痰液涂片，在空气中干燥，经火焰固定。 2、初染：用木夹持玻片，滴加石炭酸复红液于涂膜上，于火焰高处徐徐加热直至有蒸汽出现（不可沸腾）。当染液蒸发时，应将载玻片离开火焰，及时滴加染液。如此反复数次，维持约5min。玻片冷却后水洗。 3、脱色：用3％盐酸酒精脱色，至无红色染液流下为止，一般需1～2min，然后水洗。 4、复染：用碱性美蓝液复染1min。水洗，干后镜检。 结果：结核杆菌等抗酸性细菌染成红色，非抗酸性细菌及标本中的其他细胞等均染成蓝色。

抗酸染色

染色法总结 革兰染色法： 结晶紫 碘液 95%乙醇 复红 抗酸染色： 石炭酸复红 3%盐酸酒精 美兰 其它特殊染色 抗酸染色 结晶紫 碘液 95%乙醇 复红 抗酸染色： 石炭酸复红 3%盐酸酒精 美兰 其它特殊染色 1min 脱色 5min 1min 抗酸染色 革兰阳性 革兰阴性