沉默NET-1基因 对肝癌细胞生物学行为的影响 陈莉，王桂兰，秦婧，吴园园，朱建伟 南通大学附属肿瘤医院病理科 南通大学医学院病理学教研室

一、项目研究背景 肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma HCC）是全球性的健康问题之一。我们南通启东是WHO确定的HCC高发研究现场。 研究基于我们的首次发现NET-1在HCC组织中特定表达，并发现该基因参与HCC细胞的分裂增殖和癌发生、发展密切相关的细胞运动过程,探讨针对NET-1的siRNA抑制肝癌癌细胞株(SMMC-7721)中NET-1基因的表达，及该基因对癌细胞增殖、迁移、内吞的影响。

NET-1与NET-2到NET-7一起统称为NET-X，它们是由Serru等于2000年在EST 数据库中发现的7 个新的含4 次跨膜蛋白超家族( transmembrane 4 superfamily 或tetraspan family, 简称TM4SF) 的成员。 NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1) 定位于染色体1p34.1上，其mRNA全长为1297bp(基因库登记号码AF065388)，为TM4SF的成员之一，最近证实其为肿瘤相关基因。

一、 材料与方法 1、NET-1siRNA表达质粒和myc-NET-1重组表达质粒的构建 。 2、细胞培养与转染。 3、细胞内总RNA抽提及RT-QPCR检测NET-1m RNA。 4、Western blot检测NET-1蛋白表达。 5、CCK-8法检测细胞增殖活性。 6、流式细胞仪(FCN)检测各组细胞处于不同细胞周期中的比例与增殖指数。 7、细胞划痕试验检测细胞二围空间的迁移能力。 8、Transwell小室检测细胞三围空间的迁移能力。 9、Capture-ELISA方法测量细胞内生物素标记的转铁蛋白水平。 10、 anti-uPAR标记的癌细胞伪足形成实验。

二、结果 1. 检测人体组织中NET-1mRNA表达 锁定研究目标—— HCC 系统 组织 成人组织 胎儿组织 恶性组织   系统 组织 成人组织 胎儿组织 恶性组织 第一组 第二组 第三组 消化系统 胃 + NA* + 食道 + NA NA 小肠 + NA NA 结肠 + NA NA 直肠 + NA + 胰腺 － NA + 肝 － － + 泌尿生殖系统 肾 + + + 睾丸 + + + 宫颈 + NA (halan 细胞l) + 宫体 + NA + 前列腺 + NA NA 乳腺 + NA NA 内分泌系统 垂体 + NA NA 甲状腺 + NA NA 肾上腺 + NA NA 淋巴造血系统 造血细胞 － NA －** 淋巴结 + NA NA 骨髓 － NA NA 脾脏 + NA NA 胸腺 + NA NA 神经系统 脑 + + NA 脊髓 + NA NA 视网膜 + NA NA 其他 心 － + 黑色素瘤 + 肺 + + NA 肌肉 + + NA 皮肤 + + NA 胎盘 + NA NA *NA:现在未做检测； **白血病，淋巴瘤 二、结果 1. 检测人体组织中NET-1mRNA表达 锁定研究目标—— HCC M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Lanes M: 200ng of 1kb size ladder (New England BioLabs); Lanes1-3: Normal Fetal Liver Tissues; Lanes 4-7: Normal Adult Liver Tissues; Lanes 8 -11: Liver Cancer Tissues

2、RT-QPCR检测转染NET-1siRNA和myc-NET-1细胞中NET-1 mRNA的结果 转染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721细胞中NET-1mRNA的表达（RT-QPCR） 以未处理组为1。NET-1-siRNA组和myc-NET-1组分别与未处理组相比 (●P<0.05，●●p<0.01)； NET-1-siRNA组与pU6H1-GFP组相比(▲P<0.05，▲p<0.01)；myc-NET-1组与pcDNA3.1/myc组相比(★ P<0.05，★★p<0.01)

3. NET-1蛋白表达在HCC组织中显著高于癌旁组织中。 ß-actin Lanes 1,3,5,7 cancerous tissues; Lanes2,4,6,8: adjacent noncancerous tissues

4. 干扰NET-1 可以抑制HCC细胞增殖 （1）随时间的延长NET-1-siRNA处理组细胞增殖明显减少； NET-1稳定表达组细胞增殖明显增多。

GFPsiRNA组 NET-1 siRNA组 （2）NET-1-siRNA处理组细胞存在G0/G1和G2/M期阻滞，G0/G1和G2/M期细胞比例分别增加了17.04%和10.97%，S期细胞比例降低。NET-1稳定表达组细胞更快地进入细胞周期进程，G0/G1期细胞比例明显降低。 NET-1过表达组 对照组

5. 干扰NET-1 可以抑制HCC细胞迁移 在NET-1siRNA组中显著减少(p<0.05)，在myc-NET-1组中明显增加(p<0.05)。Mock组与未处理组间差异未见显著统计学意义（均p>0.05） NET-1 siRNA处理细胞后迁移能力明显下降。

转染48h后穿过Matrigel胶细胞数NET-1 siRNA组（21. 42±5. 74）和pU6H1-GFP（45. 60±8 转染48h后穿过Matrigel胶细胞数NET-1 siRNA组（21.42±5.74）和pU6H1-GFP（45.60±8.25）差异有显著统计学意义（P<0.05）；myc-NET-1组（64.80±6.14）和pcDNA3.1/myc（38.20±7.22）差异有显著统计学意义（P<0.05）。

6. 干扰NET-1 可以抑制HCC细胞内吞 未处理 anti-NET-1 兔IgG NET-1siRNA GFP-siRNA 转铁蛋白(Tfn)内吞实验显示，NET-1 siRNA组癌细胞的内吞能力明显下降。其他组间的内吞作用变化不明显 。

7. 干扰NET-1 可以抑制HCC细胞侵袭伪足形成 NET-1siRNA处理细胞伪足形成细胞百分比明显减少(p<0.01) NET-1siRNA处理细胞中以anti-uPAR标记的癌细胞伪足明显减少。

8.干扰NET-1 可以抑制裸鼠HCC的生长 myc-NET-1 NET -1 siRNA

9.NET-1表达与HCC临床病理因素和预后的研究 （2）Kaplan-Meier生存曲线 (1) NET-1表达与HCC临床病理因素密切相关。

（3）Cox比例风险模型多因素生存分析 HCC转移、组织学分级，癌中NET-1、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA表达均具有独立的预后意义。 风险分析提示这些因素增强时均能增加HCC病人的死亡风险(其风险比均＞1)

三、讨论 本文通过构建NET-1siRNA和myc-NET-1表达质粒，并转染肝癌细胞SMMC-7721。研究发现NET-1基因参与肝癌细胞的增殖分裂活动，干扰肝癌细胞NET-1基因的表达，可以抑制癌细胞的增殖，使细胞生长受限，可以抑制细胞在二围、三围空间的迁移能力、癌细胞内吞能力和侵袭性伪足形成能力。相反，增加NET-1基因的表达，癌细胞表现为显著增生，更快地进入细胞周期，迁移能力提高。研究结果揭示了肝癌细胞中NET-1基因的功能，为肝癌的发生、发展机制增添了新的内容。 NET-1表达与HCC临床病理因素和预后相关性的研究显示为NET-1表达与HCC的组织学分型、病理分级、脉管转移等临床病理因素密切相关。癌中NET-1高表达患者生存期明显减少、 NET-1高表达具有独立的预后意义。 NET-1 高表达能增加HCC病人的死亡风险。

四、项目研究创新点 1.首次发现NET-1在肝脏良恶性组织中表达的特点。 2.在HCC细胞中干扰NET-1表达，抑制癌细胞的迁移、 印迹等多种实验，具有临床推广使用的可行性与价值。

致 谢 1、该课题研究历时9年先后得到了江苏省教育厅高新技术课题和南通市社会发展课题 的经费资助。 2、NET-1抗体的合成得到了美国旧金山基因生物技术公司的协助。 3、 课题完成共培养硕士学位毕业研究生12位。他们为该课题中做了大量的工作，付出了辛勤的汗水，奉献了卓越的智慧。

Thank you ！