第三章 细胞质膜与跨膜运输 熊 涛.

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第一节、细胞膜 —— 系统的边界 1 、选择材料 : 1 、选择材料 : 2 、实验原理 : 人或其他哺乳动物成熟红细胞 渗透作用 3 、观察现象 : 可以看到近水的部分红细胞发生变化, 凹陷消失,细胞体积增大,很快细胞涨 裂,内容物流出。 一、实验:体验制备细胞膜的方法 5 、选材原因:动物细胞没有细胞壁,因此选择动物细.
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第三章 细胞质膜与跨膜运输 熊 涛

细胞质膜 概述 细胞膜的结构 细胞膜的功能 红细胞膜结构 膜的化学组成 膜的分子结构及特点

细胞的膜结构 细胞膜(cell membrane)是细胞膜结构的总称。有时特指细胞质膜。 细胞质膜(plasma membrane)是指包围在细胞表面的一层极薄的膜,主要由膜脂和膜蛋白组成。质膜的基本作用是维护细胞内微环境的相对稳定,并参与同外界环境进行物质交换、能量和信息传递。在细胞的生存、生长、分裂、分化中起重要作用。 生物膜(biomembrane):细胞所有膜结构的统称,包括细胞内膜和质膜。

细胞膜的功能 界膜和区室化 调节运输:膜对物质的运输具有选择性 功能定位与组织化 信号的检测与传递 参与细胞间的相互作用 能量置换

红细胞膜结构 红细胞(red blood cell, erythrocyte) 红细胞的生物学 是结构最简单的细胞,也是研究膜结构的最好材料。 红细胞的生物学 形态结构:成熟的红细胞呈双面凹或单面凹陷的盘状,直径约为7μm,厚度1.7μm,表面积为145μm2; 表面积与体积的比值较大,有得于细胞变形、气体交换和携带。 也是研究膜结构的最好材料:原因 RBC细胞数量大,取材容易,极少有其他类型的细胞污染;其次,成熟的哺乳动物的细胞中没有细胞核和线粒体等膜相细胞器。细胞质膜是它的唯一膜结构,所以分离后不存在其他膜污染的问题。

红细胞的功能 红细胞的主要功能是携带O2和运输CO2 红细胞血影 红细胞吸水膨胀形成裂口后释放出内含物,形成开口的红细胞血影或封闭的血影。若是红细胞完全瓦解,破裂的小片也会自我封闭形成正常的小泡或外翻的小泡。

红细胞质膜 红细胞的寿命约为120天,一生中要行走500,000米。 红细胞膜骨架 红细胞膜(含膜骨架部分)大约有15种主要的蛋白带: 膜骨架赋予红细胞质膜既有很好的弹性又具有较高强度。 红细胞膜(含膜骨架部分)大约有15种主要的蛋白带: 血影蛋白(Spectrin) 血型糖蛋白(Glycophorin) 带3蛋白(Band 3 protein) 红细胞要穿过小于自身直径一半的微小通道(脾窦)、在脾脏内要经受氧少、低PH值等不得环境的考验、在心脏内又要受到瓣膜涡流冲击。不难想象,RBC在这样长而艰险的运输途径中保持结构的完好,它的质膜起了重要作用。 锚蛋白:一方面与血影蛋白相连,另一方面与跨膜的带3蛋白的细胞抽结构域部分相连,从而将血影蛋白固定到红细胞膜上。 10.4 MEMBRANE EFFECTS IN A RED BLOOD CELL Red blood cells must deform when they squeeze through small blood vessels. In this experiment a red blood cell is pushed and deformed with laser tweezers. It quickly springs back to its original shape because it has an extremely tough cytoskeleton to which the plasma membrane is anchored. When the cell is placed in high-salt solution, however, the shape changes dramatically. Driven by the difference in osmotic pressure, water rushes out of the cell causing spikelike protrusions to form as the cell collapses. 10.3 MEMBRANE DISRUPTION BY DETERGENT When detergent is added to this red blood cell, its membrane ruptures, and the cytosol spills out.

血影蛋白、肌动蛋白、锚定蛋白、带4.1蛋白等,这些都是外周蛋白。 红细胞膜蛋白的组成 血影蛋白:膜下蛋白,膜骨架的重要成分,占膜提取蛋白的30% 血型糖蛋白A:单次跨膜糖蛋白 带3蛋白:具有阴离子转运功能 锚蛋白:将血影蛋白固定到RBC膜上 肌动蛋白、带4.1蛋白、内收蛋白 膜骨架蛋白的主要成分包括 血影蛋白、肌动蛋白、锚定蛋白、带4.1蛋白等,这些都是外周蛋白。 锚蛋白 肌动蛋白 原肌球蛋白 血影蛋白 带3蛋白 血型糖蛋白A

膜的化学组成 膜的化学组成:脂/蛋白质/糖 膜中蛋白质与脂的比例,依据膜的类型(质膜、内质网膜)、细胞类型(肌细胞、肝细胞)、生物类型(动物、植物和原核生物)的不同而不同。 蛋白质/脂:与膜的功能密切相关, 线粒体 >> 红细胞

膜 脂 生物膜上的脂类统称为膜脂,其分子排列呈连续的双层,构成了生物膜的基本骨架。 膜 脂 生物膜上的脂类统称为膜脂,其分子排列呈连续的双层,构成了生物膜的基本骨架。 所有的膜脂都具有两亲性:一个亲水末端(极性端)和一具疏水端(非极性端)。 膜脂的主要类型 磷脂、鞘脂、胆固醇 磷脂的分子结构:一个甘油分子与两个脂肪酸分子相连,在甘油的第三个羟基上连接的不是长链脂肪酸,而是一个磷酸分子,磷酸分子后面还连另一个小分子(胆碱、乙醇胺或丝氨酸等)。

胆固醇 占膜脂的50% 对磷脂的脂肪酸尾部的运动具有干扰作用,所以胆固醇对调节膜的流动性、加强膜的稳定性有重要作用。 胆固醇在脂双层中的位置

Lipoprotein is an Class of Naturally Existing Nanostructures

Low-Density Lipoprotein (LDL) Nanoparticle Goldstein and Brown won 1985 Nobel Prize for elucidating LDL receptor (LDLR) pathway LDL delivery count for 90% of cholesterol supply (only 10% from de novo synthesis) Endogenous carrier ⇒ nonimmunogenic and escape RES escape RES ⇒ biocompatible and biodegradable

基于LDL的纳米平台技术 靶向LDL受体 靶向其它的癌症信号 ~22nm 完整的 ApoB-100 信号通过LDL受体扩大 通过覆盖Lys或改变apoB-100的构型,以封闭与LDL受体的结合位点。 偶联肿瘤相对特异性靶分子的配体或多肽 LDL低密度脂蛋白,是人体血浆中运输胆固醇的主要蛋白,是调节细胞生长和激素产生所需固醇的主要物质。相对于肝和肾上腺,许多肿瘤细胞由于快速增殖需要大量的胆固醇以合成新的细胞膜,因而高表达LDL受体。 生物相容性好(无免疫原性,能够逃避内皮网状系统,可生物降解) 多功能 (结合MRI和NIRF成像,成像和治疗) 靶向性可变 (LDLR或非LDLR) 纳米尺寸可调(过装载LDL或用不同尺寸的脂蛋白)

膜脂的特性和功能 在水溶液中能够自动形成微球或双分子层结构; 脂双层的厚度为6nm; 膜脂的主要功能是构成膜的基本骨架。

脂质体 人工制备的连续脂双层的球形脂质小囊; 作为生物膜的研究模型; 作为生物大分子(如DNA分子)和药物的载体。 ( (b)球形脂质体; (c)平面脂质体膜; d)用于疾病治疗的脂质体的示意图

膜 糖 膜糖的位置:细胞质膜上所有膜糖都位于质膜的外表面,内膜系统中的膜糖则位于内表面。 膜糖的种类:动物细胞质膜上主要有7种 膜 糖 膜糖的位置:细胞质膜上所有膜糖都位于质膜的外表面,内膜系统中的膜糖则位于内表面。 膜糖的种类:动物细胞质膜上主要有7种 D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸 膜糖的存在方式: 通过共价键同膜脂或膜蛋白相连,即以糖脂或糖蛋白的形式存在于细胞质膜上。 真核生物细胞膜上的蛋白质几乎都是糖蛋白。糖蛋白主要存在于细胞质膜上,内膜中糖蛋白极少。

膜糖的功能 提高膜的稳定性,增强膜蛋白对细胞外基质中蛋白酶的抗性,帮助膜蛋白进行正确的折叠维持正确的三维构型; 参与细胞的信号识别、细胞的粘着; 糖蛋白中的糖基还帮助新合成蛋白质进行正确的运输和定位; ABO血型决定子(determinant),即ABO血型抗原,它是一种糖脂, 其寡糖部分具有决定抗原特异性的作用。 A血型的人红细胞膜脂寡糖链的末端是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc), B血型的人红细胞膜脂寡糖链的末端是半乳糖(Gal), O型则没有这两种糖基, AB型的人则在末端同时具有这两种糖。 膜糖的功能 提高膜的稳定性,增强膜蛋白对细胞外基质中蛋白酶的抗性,帮助膜蛋白进行正确的折叠维持正确的三维构型。 参与细胞的信号识别、细胞的粘着。如同某些糖脂一样,膜蛋白中的糖基是细菌和病毒感染时的识别和结合位点。 糖蛋白中的糖基还帮助新合成蛋白质进行正确的运输和定位。 ABO血型决定子(determinant),即ABO血型抗原,它是一种糖脂, 其寡糖部分具有决定抗原特异性的作用(图3-18)。 A血型的人红细胞膜脂寡糖链的末端是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc), B血型的人红细胞膜脂寡糖链的末端是半乳糖(Gal), O型则没有这两种糖基, AB型的人则在末端同时具有这两种糖。

膜蛋白(membrane protein) 膜蛋白分类 内在(整合)膜蛋白(intrinsic/integral membrane proteins):水不溶性蛋白,形成跨膜螺旋,与膜结合紧密, 需用去垢剂使膜崩解后才可分离。 外在(外周)膜蛋白(extrinsic/peripheral membrane proteins ):水溶性蛋白,靠离子键或其它弱键与膜内表面的蛋白质分子或脂分子极性头部非共价结合,易分离。 脂质锚定蛋白(lipid-anchored proteins):通过磷脂或脂肪酸锚定,共价结合。

膜蛋白的功能 功能蛋白 示例 作用方式 运输蛋白 Na+泵 主动将Na+泵出细胞,K+泵入细胞 连接蛋白 整合素 将细胞内肌动蛋白与细胞外基质蛋白相连 受体蛋白 血小板生长因子(PDGF)受体 同细胞外的PDGF结合、在细胞质内产生信号, 引起细胞的生长与分裂 酶 腺苷酸环化酶 在细胞外信号作用下,导致细胞内cAMP产生

膜蛋白的研究方法 膜蛋白的分离 去垢剂的作用机理 去垢剂可分为离子型和非离子型两种 去垢剂是一端亲水一端疏水的双亲媒性分子, 它们具有极性端和非极性的碳氢链。当它们与膜蛋白作用时,可以用非极性端同蛋白质的疏水区作用,取代膜脂,极性端指向水中, 形成溶于水的去垢剂-膜蛋白复合物, 从而使膜蛋白在水中溶解、变性、沉淀。 去垢剂可分为离子型和非离子型两种 十二烷基磺酸钠(SDS)是常用的离子型去垢剂,它不仅可使细胞膜崩溃,并与膜蛋白的疏水部分结合使其分离,而且还破坏膜蛋白内部的非共价键,使蛋白变性,所以不宜用于分离有功能的膜蛋白。 Triton X-100是温和性去垢剂,它可以使膜脂溶解,又不使蛋白变性,可分离到有生物功能的膜蛋白。 膜蛋白的分离 十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100都是去垢剂,哪一种可用于分离有生物功能的膜蛋白? 十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100都是去垢剂,哪一种可用于分离有生物功能的膜蛋白?(答案) 答:去垢剂可分为离子型和非离子型两种。十二烷基磺酸钠(SDS)是常用的离子型去垢剂,它不仅可使细胞膜崩溃,并与膜蛋白的疏水部分结合使其分离,而且还破坏膜蛋白内部的非共价键,使蛋白变性,所以不宜用于分离有功能的膜蛋白。Triton X-100是温和性去垢剂,它可以使膜脂溶解,又不使蛋白变性,可分离到有生物功能的膜蛋白。 ● 去垢剂的作用机理 去垢剂是一端亲水一端疏水的双亲媒性分子, 它们具有极性端和非极性的碳氢链。当它们与膜蛋白作用时,可以用非极性端同蛋白质的疏水区作用,取代膜脂,极性端指向水中, 形成溶于水的去垢剂-膜蛋白复合物, 从而使膜蛋白在水中溶解、变性、沉淀(图3-23)。

膜的分子结构及特点 结构模型 寡糖 糖脂 内在蛋白 磷脂 胆固醇 1935年提出"双分子片层"结构模型 流动镶嵌模型; 生物膜结构模型

膜的不对称性 细胞质膜的不对称性是指细胞质膜脂双层中各种成分不是均匀分布的,包括种类和数量的不均匀。 膜脂的不对称性 膜蛋白的不对称 膜糖的不对称 不对称性的意义 膜脂、膜蛋白及膜糖分布的不对称性导致了膜功能的不对称性和方向性。保证了生命活动的高度有序性。 膜脂的不对称性 膜脂的不对称性表现在脂双层中分布的各类脂的比例不同, 各种细胞的膜脂不对称性差异很大 膜蛋白的不对称 每种膜蛋白在膜中都有特定的排布方向,与其功能相适应,这是膜蛋白不对称性的主要因素。膜蛋白的不对称性包括外周蛋白分布的不对称以及整合蛋白内外两侧氨基酸残基数目的不对称 膜糖的不对称 膜糖以糖蛋白或糖脂的形式存在,无论是糖蛋白还是糖脂的糖基都是位于膜的外表面

膜的流动性 膜的流动性是指构成膜的脂和蛋白质分子的运动性。膜的流动性不仅是膜的基本特性之一, 也是细胞进行生命活动的必要条件。 膜的流动性的生理意义 细胞质膜适宜的流动性是生物膜正常功能的必要条件。 酶活性与流动性有极大的关系,流动性大活性高。 如果没有膜的流动性,细胞外的营养物质无法进入,细胞内合成的胞外物质及细胞废物也不能运到细胞外,这样细胞就要停止新陈代谢而死亡。 膜流动性与信息传递有着极大的关系。 如果没有流动性,能量转换是不可能的。 膜的流动性与发育和衰老过程都有相当大的关系。   3.4.3 膜的流动性(membrane fluidity) 膜的流动性是指构成膜的脂和蛋白质分子的运动性。膜的流动性不仅是膜的基本特性之一, 也是细胞进行生命活动的必要条件。 膜的流动性的生理意义何在?(答案) 答:① 细胞质膜适宜的流动性是生物膜正常功能的必要条件。 ② 酶活性与流动性有极大的关系,流动性大活性高。 ③ 如果没有膜的流动性,细胞外的营养物质无法进入,细胞内合成的胞外物质及细胞废物也不能运到细胞外,这样细胞就要停止新陈代谢而死亡。 ④ 膜流动性与信息传递有着极大的关系。 ⑤ 如果没有流动性,能量转换是不可能的。 ⑥ 膜的流动性与发育和衰老过程都有相当大的关系。   10.1 FLUIDITY OF THE LIPID BILAYER To demonstrate the fluidity of the lipid bilayer, a piece of the plasma membrane of this neuronal cell is pulled out with laser tweezers. Remarkably, moving this membrane tubule rapidly back and forth does not rupture the plasma membrane, which flows quickly to adapt to the mechanical distortion. 9.1 LASER TWEEZERS The light of a laser beam that is focused into a cone through a microscope objective exerts small forces that can trap particles with high refractive indices near the focal point. This experimental set-up is called ‘laser tweezers.’ It can be used to move small particles, including cells and organelles.

流动性的表现形式 膜脂的运动方式(脂的流动是造成膜流动性的主要因素) 膜蛋白的运动 侧向扩散(lateral diffusion) 旋转运动(rotation) 伸缩运动(flex) 翻转扩散(transverse diffusion) 膜蛋白的运动 随机移动 定向移动 局部扩散 ■ 流动性的表现形式 ● 膜脂的运动方式 脂的流动是造成膜流动性的主要因素,概括起来,膜脂的运动方式主要有四种。 ① 侧向扩散(lateral diffusion); ② 旋转运动(rotation); ③ 伸缩运动(flex); ④ 翻转扩散(transverse diffusion), 又称为翻转(flip-flop)。 沿膜平面的侧向运动(基本运动方式),其扩散系数为10-8cm2/s; 脂分子围绕轴心的自旋运动; 脂分子尾部的摆动; 双层脂分子之间的翻转运动,发生频率还不到脂分子侧向交换频率的10-10。但在内质网膜上,新合成的磷脂分子翻转运动发生频率很高。 ● 膜蛋白的运动 由于膜蛋白的相对分子质量较大,同时受到细胞骨架的影响,它不可能象膜脂那样运动。主要有以下几种运动形式(图3-37): ① 随机移动 有些蛋白质能够在整个膜上随机移动。移动的速率比用人工脂双层测得的要低。 ② 定向移动 有些蛋白比较特别,在膜中作定向移动。例如,有些膜蛋白在膜上可以从细胞的头部移向尾部。 ③ 局部扩散 有些蛋白虽然能够在膜上自由扩散,但只能在局部范围内扩散。

膜流动性的研究方法 人、鼠细胞融合实验 1970年,L. David Frye 和Michael Edidin 进行了人、鼠细胞融合实验,令人信服地证明了膜蛋白的流动。 免疫球蛋白与单克隆抗

淋巴细胞的成斑和成帽反应 通过抗体交联膜蛋白分子聚集成斑(patching)、成帽(capping)的现象也是证明膜蛋白在膜平面侧向扩散的例子。

光脱色荧光恢复技术 这种方法不仅能够证明膜的流动性,同时也能测量膜蛋白扩散的速率。 (fluorescence recovery after photobleaching FRAP) 这种方法不仅能够证明膜的流动性,同时也能测量膜蛋白扩散的速率。

细胞质膜的功能

非离子型去垢剂的作用机制

Glycophorin

带3蛋白的功能 碳酸酐酶 由于气体CO2难溶于水溶液,进入红细胞后就难以溶解到红细胞的细胞质中。这要依赖于红细胞抽中的碳酸酐酶,它可将CO2转变成水溶液性的碳酸氢根阴离子 (HCO3-)。水溶性的碳酸氢根阴离子 通过红细胞质膜中的带3蛋白,同Cl-进行交换排出红细胞,所以将带3蛋白称为阴离子交换蛋白。 CO与HB的亲合力远大于O2。

磷脂酰丝氨酸外翻分析 (Annexin V法) 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)  磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。   碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。   方法   1 悬浮细胞的染色:将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室温避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反应5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h), 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。   2 贴壁培养的细胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。   3 爬片细胞染色:同上,最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。   结果 [图4、图5]   注意事项   1. 整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。   2. 操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。

细胞凋亡 17.1 APOPTOSIS Programmed cell death or apoptosis has been induced in these cultured cells. Cell death is characterized by blebbing of the plasma membrane and fragmentation of the nuclei. Suddenly, cells lose all attachment to the substratum that they have been growing on and shrivel up without lysing. The mechanism of apoptosis involves many tightly controlled steps, three of which are visualized here by different staining techniques. One initial event is the sudden release of cytochrome c from mitochondria into the cytosol. This event has been visualized here using fluorescently labeled cytochrome c. Initially the green/yellow staining is restricted to a reticular pattern which then suddenly disperses as the mitochondria release their content proteins into the cytosol. At a later step, the lipid asymmetry of the plasma membrane breaks down. In normal cells, phosphatidyl serine is only found on the cytosolic side of the plasma membrane, but when cells undergo apoptosis, it becomes exposed on the outside of the cell. This event has been visualized here by adding a red fluorescent protein to the media which specifically binds to phosphatidyl serine head groups as they become exposed. In an intact organism, exposure of phosphatidyl serine on the cell surface labels the dead cell and its remnants to be rapidly consumed by other cells, such as macrophages. Finally—although apoptosing cells don’t lyse—their plasma membranes do become permeable to small molecules. This event has been visualized here by adding a dye to the media that fluoresces blue when it can enter cells and bind to DNA. All three of these events can be observed simultaneously.

Imaging apoptotic response in vivo vivo. (a) Planar fluorescence image. (b) Four consecutive FMT slices (in color) superimposed on the planar image of the mouse obtained at the excitation wavelength. The bottom right slice is the one closer to the surface of the animal as seen in a, and successive slices are reconstructed fromdeeperin the animal. (candd)TUNELstained histological slices from the sensitive LLC and resistant CR-LLC tumors. Vasilis Ntziachristos, et al. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V–Cy5.5 conjugate, PNAS, 2004, 101(33): 12294–12299.