实验八 食品中维生素A含量的测定 营养与食品卫生学教研室
高效液相色谱法 【目的】 【原理】 1．了解高效液相色谱法测定维生素A的原理。 2．熟悉高效液相色谱仪的使用。 样品中的维生素A经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。
【试剂】 【仪器】 1．高效液相色谱仪 （附紫外分光检测器） 1.无水乙醚 2.无水乙醇 2．高速离心机 3.三氯甲烷 3．旋转蒸发器 4.维生素A标准溶液（1mg视黄醇/ml） 5.内标物溶液（10μg苯并[e]芘 /ml） 【仪器】 1．高效液相色谱仪 （附紫外分光检测器） 2．高速离心机 3．旋转蒸发器 4．振荡混匀器 5．恒温水浴箱
【操作】 1．实验条件 分析柱：Diamonsil(钻石)C18柱，5µm，150×4.6mm 柱 温：35℃ 柱 温：35℃ 流动相：100%甲醇，于临用前超声波脱气20min或在线脱气 流 速：1.0ml/min 紫外检测器波长：300nm 进样量：10µl 在上述色谱条件下测定，维生素A保留时间约为3.3min。
2．标准曲线的制备 （1）维生素A标准液浓度标定 准确吸取维生素A标准液Sµl，分别用无水乙醇稀释至 3.00ml，并按下表中给定波长分别在紫外分光光度计上 测定各维生素溶液的吸光值。利用比吸光系数计算出该维 生素标准液的浓度。 标准类别 加入标准储备液的量(µl) 比吸光系数Ecm1% 波长π(nm) 视黄醇 10.0 1835 325
2．标准曲线的制备 （1）维生素A标准液浓度标定 标准液浓度计算： 某维生素标准液浓度(mg/ml) =A/E×l/100×3.00×103/S×1000 式中：A — 维生素标准液的平均紫外吸光值； E — 该维生素1%比吸光系数； S — 加入标准液的量((µ1) 3.00×103/S — 标准液稀释倍数。
2．标准曲线的制备 （2）标准曲线的绘制 准确吸取维生素A标准液20.0µl，用无水乙醇稀释至3.00ml。取稀释后维生素A标准液100、200、500、1000µl置于小塑料离心管中，每管加入内标10µg/ml苯并[e]芘溶液250µl，并用无水乙醇稀释至1.25ml，混合均匀。选择合适灵敏度，取上述不同浓度的标准液各10µl，依次注入高效液相色谱仪进行色谱分析。维生素标准曲线以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或建立直线回归方程。
3．样品测定 （1）皂化 称取1～10g样品，置于250ml皂化瓶中，加30ml无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加100g/L抗坏血酸溶液5ml，10mg/ml苯并[e]芘标准液0.4ml，混匀。再加10ml氢氧化钾溶液，混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。
3. 样品测定 （2）提取 将皂化后的样品移入250ml分液漏斗中，用50ml蒸馏水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100ml乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层 （3）洗涤 用约50ml蒸馏水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层呈中性(一般需6次左右，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)
3. 样品测定 （4）浓缩 在三角漏斗内垫少许脱脂棉，加入无水硫酸钠(约5g)将乙醚提取液经过无水硫酸钠滤入与旋转蒸发器配套的250～300ml球形蒸发瓶内，用约10ml乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2ml乙醚时，取下蒸发瓶，用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00ml无水乙醇，充分混合，溶解提取物。
3. 样品测定 （5）定容 将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min(5000r/min)，上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。 （6）色谱分析 取样品浓缩液10µl，注入高效液相色谱仪进行分析。以标准品色谱峰的保留时间定性，根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，在标准曲线上查出其相应的维生素含量。或用回归方程求出其含量。
【计算】 式中： C — 由标准曲线上查到的某种维生素含量，µl/ml V — 样品浓缩定容体积，ml M — 样品质量，g
【注意事项】 （1）维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色 玻璃仪器。 （2）在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。 （3）提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。 （4）洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。 （5）无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。 （6）在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量损失。 （7）用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果 偏低。
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