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荧光分光光度术 Spectrophotofluorimetry

荧光分光光度术 一、荧光的发现 二、荧光与荧光光谱 三、荧光光谱仪及主要谱参量 四、荧光生色团的结构特点 五、影响荧光测量的因素 六、荧光技术在生物学、医学研究中的应用

夜明珠发光成因 1、矿物的发光性 矿物在外来的能量激发下，产生可见光的性质称为矿物的发光性。 夜明珠发光成因 1、矿物的发光性 矿物在外来的能量激发下，产生可见光的性质称为矿物的发光性。 外来的能量有日光、紫外线、X射线、阴极射线、加热、加压、摩擦等。 根据其发光的性质不同，分为荧光和磷光二类。 2、矿物的发光机理 矿物的发光是矿物能量的一种转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态 （非稳定态）在反回到基态的过程中，以光的形式放出能量。

一 荧光的发现 1575：N.Monardes Lignum Nephriticum 1852：Stokes 分光计 一 荧光的发现 1575：N.Monardes Lignum Nephriticum 1852：Stokes 分光计 植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁 借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演，荧光 Fluorescence 1867年：Goppelsroder AL 与桑色素的配合测定AL 的含量 1880：Liebeman 提出“荧光与化学结构关系”的经验法则 为荧光技术的开发应用拉开了序幕

二 荧光与荧光光谱 （一） 荧光的产生 （二）荧光光谱与吸收光谱

（一） 荧光的产生 1 分子的能量状态 在光学分析中涉及的分子能量有： Eo=Ee+ Ev + Er Ee：价电子运动能, electron 1 分子的能量状态 在光学分析中涉及的分子能量有： Eo=Ee+ Ev + Er Ee：价电子运动能, electron Ev：原子在平衡位置附近的振动,vibration Er：分子绕其重心的转动能, rotation 其中，Ee > Ev > Er

（一） 荧光的产生 2 分子的能级Energy Levels与跃迁Transition

（二）荧光光谱与吸收光谱

荧光分光光度术： 又称荧光光谱术，属于光谱技术中的一种发射光谱术。其原理是电磁波和物质作用后，物质首先吸收电磁波的能量，然后再重新发射电磁波。激发波段在100-800nm之间，相当于紫外与可见光波段。

三 荧光光谱仪与主要参量 （一）荧光光谱仪 （二）荧光分光光度术中的参量

（一）荧光光谱仪 吸收光谱仪光路图 荧光光谱仪光路图

1 激发光源 在紫外-可见光区，可供荧光激发用的光源很多包括：钨灯，碘钨灯， 氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要根据光源稳定性和强度选择光源。 氢灯的能量分布 氘灯的能量分布 氙灯（红线）和带有玻璃外套的汞灯的能量分布

实践中常不选用强光源： 随着光强的增加，会同时导致散射光和热量的增多 强光源照射，容易使样品产生光化分解 强光源需要的稳压稳流装置复杂而昂贵 产生大量臭氧，损害健康

对于光源要注意以下几点: （1）正负极不要接错。 （2） 拿灯时，不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照射后，难以清除。 应及时用无水乙醇擦干净。 （3） 灯有寿命，要节约使用。 （4） 启动间隔一般要大于半小时，待灯冷却后，在重新启动。 启动后要预热 半小时。 （5） 不要用眼睛直视灯。

2 样品池 在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。 （1）设置空白对照 。 （2）清洗问题，关键是即时冲洗。 自来水冲洗 SDS浸泡 双蒸水冲洗 浓硝酸处理 双蒸水冲洗

（二）荧光分光光度术中的参量 ex—Maximum excitation wavelength em, max —Maximum emission wavelength

（二）荧光分光光度术中的参量 Ia=I0-I，I=I010-εcL F =  I0(1-10-εcL ) 2 荧光强度（fluorescence intensity, F, I ）与 量子产率（quantum yield,  ） A 荧光强度的定义：在一定激发波长(λex)作用下，发射的 荧光强弱。 F=Ia Ia=I0-I，I=I010-εcL F =  I0(1-10-εcL ) {当C很低时F=  I0εcL ， {当C较大时F=I0 B =发射光子数/吸收光子数

荧光强度与浓度的关系

（二）荧光分光光度术中的参量 荧光偏振( fluorescence polarization) 自然光 部分偏振光 偏振光

I//-I I//+I I//-I I//+2I P= I//-I I//+2I A= 荧光偏振度Fluorescence polarization --p 荧光各向异性Fluorescence anisotropy -- A

(1) 荧光偏振度的物理意义： A ：I//=I ，P=0，自然光，荧光分子运动很快，取 向随机。（稀溶液） B：I//或I为0 ，P=±1 偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。 C： I//I  0 ，0<P<1，生物大分子的荧光属于这种情况。

(2) 环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响 A：温度的影响 温度升高，P降低 B：溶液粘度 粘度升高，P升高 C：分子的运动—转动 A .温度的影响： 溶液粘度 旋转弛豫时间rotational relaxation time — 

（二）荧光分光光度术中的参量 4 荧光寿命 （Fluorescence liftime --） I=I0e-kt , =1/k 分子所处的环境 有无淬灭 影响因素 有无能量转移 有无分子间相互作用

5 荧光探剂 具有环状共轭双键即π电子系统 量子产率随环境变化，而且变化很大 (3) 能产生稳定荧光的小分子 藻胆蛋白phycobiliprotein 绿色荧光蛋白Green Fluorescent Protein (4) 与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价 结合

（5）荧光探针的应用分类 测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针 膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针， 　　　　　　其它非极性和双亲性膜探针。 细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针 Ca2＋， Mg2＋， Zn2＋ ，Na＋， K＋， Cl－等离子荧光探针 pH荧光探针: 近中性pH应用的探针，酸性，探针交联物 活性氧和一氧化氮探针 细胞骨架蛋白荧光探针 信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针 入胞作用、受体和离子通道探针pH 细胞形态和流体测量的荧光示踪剂

四 荧光生色团的结构特点 1 天然荧光生色团的结构特点 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 四 荧光生色团的结构特点 1 天然荧光生色团的结构特点 （1）碳原子骨架： 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高π电子共轭度的结构改变，都将提高 荧光效率。 例如：对苯基化，间苯基化等。

四 荧光生色团的结构特点 （2）分子的几何排布： 具有刚性平面结构 酚酞 荧光素

四 荧光生色团的结构特点 （3）取代基的类型： （1）加强荧光的基团：给电子取代基， -NH2, -NHR, -OH,-OR, -CN,-OCH3,-OC2H5 （2）减弱荧光的基团：得电子取代基， -CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I （3）影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH3 （4）取代基的位置： 邻位、对位—荧光增强，间位—荧光减弱（-CN基例 外） (5)环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影响荧光

四 荧光生色团的结构特点 2 蛋白质和核酸中的荧光生色团 Phenylalanine (F, Phe) Tryptophan 2 蛋白质和核酸中的荧光生色团 Phenylalanine (F, Phe) Tryptophan (W, Trp) Tyrosine (Y, Tyr)

四 荧光生色团的结构特点 生色团 条件 ex nm max 10-3 em F F ns 敏感度maxF 10-2 Trp H2O,pH7 280 5.6 348 0.2 2.6 11 Tyr 274 1.4 303 0.1 3.6 Phe 257 282 0.04 6.4 0.08 Y-base Yeas t-RNAPhe 320 1.3 460 0.07 6.3 0.91 亚硝基奈酚+Tyr 茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Phe ex:460nm, em:570nm ex:365nm, em:515nm

五 影响荧光测量的因素 1 光化分解（photodissociation） 光照后导致化学键断裂——荧光减弱 2 淬灭(quenching) 温度淬灭： 温度每升高10C ，荧光减少的百分比，称为温度系数。 在20-300C的范围内，温度系数大约为1.5。 浓度淬灭： 21 内滤光效应（inner filter effect) (3)杂质淬灭：3O2 1O2

3 溶液pH的影响 利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变， 可以判别各种滴定的终点。 指示剂 颜色变化 pH范围 萘 酚 无色变黄绿 8.2-10.3 荧光素 浅绿变绿 4.0-5.0 丫啶橙 8.0-10.0 浅黄绿变黄

4 溶液极性的影响 荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向 4 溶液极性的影响 荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向 （或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。 水溶液中 膜 中 DPH 发射波长：440nm 发射波长：430nm

5 溶剂和化学试剂 6 荧光污染 (1) 溶剂选择要适宜 例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。 (2) 溶剂要纯 (2) 溶剂要纯 6 荧光污染 (1) 涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞 (2) 去污剂 (3) 微生物污染 (4) 滤纸

六 荧光分光光度术的应用 (一）.物质的检测 1 测量原理： 稀溶液， F=  I0εcL 2 结构特点：含有“芳香环”结构 1 测量原理： 稀溶液， F=  I0εcL 2 结构特点：含有“芳香环”结构 3 灵敏度：10-7~10-8g/ml

检测物质 激发波长nm 发射波长nm 维生素A 345 490 维生素B2，pH7 370 565 维生素B12， pH7 275 305 维生素C 530 3,4-苯并芘10-6g/ml 381 403 5羟色胺，中性或弱酸性 295 330 5羟色胺，盐酸 550，330

（二）蛋白质的荧光分析 1 蛋白质的内源荧光 研究生物大分子构象

2 蛋白质的外源荧光

（三）核酸的荧光分析 １嘌呤及衍生物 ２嘧啶及衍生物 3 核酸的荧光标记 室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。 　　　　　　　　　　　　　酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。 　　　　　　　　　　　　　碱性介质中，鸟嘌呤有荧光 ２嘧啶及衍生物 游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低Φ＝0.0015 3 核酸的荧光标记

Probes ex em Note Ethidium Bromide 545 610 非透膜，RNA,DNA Propidium Iodine 530 615 PO-PRO-1 iodine 435 455 Acridine Orange 490 590 透膜，RNA,DNA Pyronin Y 580 Bisbenzimide 345 460 透膜，DNA

（四） 利用荧光技术检测分子间结合程度 1 用荧光偏振变化检测结合程度 当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变 1 用荧光偏振变化检测结合程度 当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变 其荧光特性（强度与偏振），通过这些参数的变化，可以了解他们结 合时的信息。 结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。

2 用荧光强度变化检测结合程度 Scatchard图 用杀鼠灵滴定HSA r λex=320nm λem=400nm = 2 用荧光强度变化检测结合程度 Scatchard图 用杀鼠灵滴定HSA r λex=320nm λem=400nm = Ka (n - r) [L] [L] = [L0] – [LP] = [L0] – r[P0]

（五） 大分子内基团间或分子间距离的测定 荧光共振能量转移 ( Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)

荧光共振能量转移的三个条件： 供体和受体都能发光 供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠 供体和受体的距离必须小于100Å

大分子内基团间或分子间距离的测定 Forster 公式 E= R06/(R6+R06) R0: 临界距离，E：转移效率，R：基团间距离 E= 1- IDA/ID IDA: 受体存在时的荧光强度， ID：受体不存在时的荧光强度

（六） 膜生物物理研究 1 膜流动性 DPH ：P值小，流动性高 2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高 2 膜渗漏性 羧基荧光素( selfquenching) 3 膜电位的测量 Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+) KO+：细胞外浓度， KI+：细胞内浓度 荧光探剂：花菁（cyanine) K+载体：缬氨霉素：

4 膜融合机理的研究 方法一 ：利用能量共振转移现象

方法二：利用淬灭现象 I I λ λ

5 膜成分扩散速度的测定 荧光漂白恢复技术 fluorescence recovery after photobleaching，FRAP 5 膜成分扩散速度的测定 荧光漂白恢复技术 fluorescence recovery after photobleaching，FRAP 1/2

ω2 D= rD 41/2 D：扩散系数，ω：光斑半径， 1/2：漂白后的荧光值恢复到稳定值的一半 常用探剂：标记脂类——DiI 标记蛋白——异硫氰荧光素（FITC），蕊香红（rhodamine）

（七） 荧光技术与其它技术的结合 对细胞内的不同成分进行定性定位或定量 2 流式细胞术 荧光，激光和计算机结合 3 激光扫描共聚焦显微镜 1 显微荧光光度术 对细胞内的不同成分进行定性定位或定量 2 流式细胞术 荧光，激光和计算机结合 3 激光扫描共聚焦显微镜 FRAP 4光镊（optical tweezers)

Fluo-3/Ca2+，AM, ex=506nm, em=526nm

思考题 1 荧光产生的机理是什么？ 2 荧光技术研究的生物学样品的主要参数有哪些？量子产率与荧光强度的区别及关系是什么？ 荧光偏振的意义是什么？ 3 举例说明荧光技术的应用？

4.如果婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为酪氨酸的酶时，则苯丙氨酸的含量异常增大而患“苯丙酮尿症”且易引起智力低下，所以，对婴幼儿的该项体查极为重要，但是，由于血液蛋白质中其它芳香氨基酸的影响而难以测出苯丙氨酸的含量，请用本课程所学内容提出一个检测方案。

参考资料 1.赵南明，周海梦，生物物理学，北京：高等教育出版 社，海德堡：施普林格出版社，2000 2.林克椿，生物物理技术波谱技术及其在生物学中的应用，北京：高等教育出版社，1989 3.林克椿，吴本玠，医学生物物理学，北京医科大学。北京大学医学出版社，2004 4.李楠，王凤翔，周春喜，荧光探针应用技术，北京：军事医学科学出版社，1998 5.Pattabhi Vasantha, Gautham N. Biophysics, Pangbourne: Alpha Science, c2002. www.probes.com