小鼠骨髓细胞微核试验 卫生毒理学 徐丹丹 15920187832

课前准备 分组：按学号或者自由组合，两人一组。 原则上每组一只小鼠，合作完成实验。 有兴趣的同学可以使用多余的实验动物，单独完成实验操作。

一、实验目的 掌握哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的原理和方法 了解微核试验的意义及应用

二、实验原理 微核（ micronucleus）如果由于某种理化因素，如辐射、染色体断裂剂和非整倍体诱变剂的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断裂，在进入分裂后期时，这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近，当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。

二、实验原理 微核（ micronucleus） 细胞主核之外，小于细胞主核1/3 圆形或杏仁形，边缘光滑整齐 染色与主核一致 一个细胞内可以存在一个或多个微核 细胞核 微核

二、实验原理 微核成因 染色体或染色单体的无着丝点断片 纺锤丝受损而丢失的整个染色体 细胞分裂后期遗留在胞质中，单独形成规则的次核

三、意义及应用 检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。 检测能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物（DNA断裂剂和非整倍体诱变剂）。 辐射损伤、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。 除了本次试验的啮齿类动物骨髓细胞微核试验外，微核试验还包括外周血淋巴细胞微核试验，双核微核实验，植物根尖细胞微核试验等。

为何选择PCE？ 嗜多染红细胞（PCE）:是分裂后期的红细胞，主核已排出,是由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段 . 正染红细胞（NCE）：成熟红细胞 PCE特点： 1、无主核、易识别微核（有核细胞中微核与正常核叶及核的突起难以鉴别） 2、胞内含核糖体，染色后成灰蓝色（区别于成熟红细胞，其无核糖体、染色呈淡橘红色） 3、骨髓中PCE数量充足，满足实验计数的要求，是首选细胞群。

四、器材与试剂 器材： 手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、滤纸、带橡皮头吸管、晾片架、玻璃蜡笔、玻璃染色架、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器、擦镜纸 试剂：小牛血清、快速Giemsa染液（试剂一、试剂二） 阳性对照物：环磷酰胺或丝裂霉素C。

五、操作步骤 1、实验动物选择与处理 动物选择：大、小鼠，小鼠最常用，18-20g，7-12周龄，每组10只，雌雄各半。 剂量选择：以1/5 LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组，同时设阳性对照（环磷酰胺或丝裂霉素C处理）和阴性对照（溶剂处理）。 染毒途径：经口、经皮、经呼吸道、注射。 染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）。

五、操作步骤 2、骨髓片的制备与观察 2.1 解剖取材 处死：颈椎脱臼法 解剖取材：胸骨、股骨 2.2 骨髓液制备及涂片 标本预处理：用滤纸包住将周围组织及肌肉、血污、骨骺剔除 玻片毛玻璃位置先用铅笔做好记号，滴一滴小牛血清 获取骨髓液：在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片：快速、均匀

五、操作步骤 固定：甲醇固定15min 染色：吉姆萨染色液（吉姆萨储备液1份，磷酸盐缓冲液9份），10—15min 2.3 固定与染色 方法一 常规吉姆萨染色法 固定：甲醇固定15min 染色：吉姆萨染色液（吉姆萨储备液1份，磷酸盐缓冲液9份），10—15min 染色原理：吉姆萨染液由天青（碱性染料），伊红（酸性染料）组成（核糖体呈酸性，易与天青结合，染成蓝紫色）。 方法二 快速Giemsa染液染色法（原理同上） 待骨髓涂片充分晾干后，将涂片平置染色架，用胶头滴管取试剂一，滴4滴于玻片上，使之充分覆盖玻片涂有骨髓的位置, 染色1分10秒. 然后用胶头滴管取试剂二，滴8滴于玻片上，使之与试剂一充分混合，反应5min. 最后用很小的水流沿玻片背面冲洗30s,充分晾干。 注：今天实验课采用方法二染色

五、操作步骤 显微镜的使用 低倍镜：细胞群 高倍镜：分布均匀、染色良好 油镜：细胞形态、微核 2.4 镜下观察 显微镜的使用 低倍镜：细胞群 高倍镜：分布均匀、染色良好 油镜：细胞形态、微核 （注意：操作显微镜时必须摘掉手套，使用完毕用无水乙醇擦净油镜上残留的油。）

五、操作步骤 2.4 镜下观察 镜下有3中细胞： PCE: 灰蓝色 NCE： 橘黄色 有核细胞：蓝紫色 微核： 蓝紫色、 圆形、 边缘规则

五、操作步骤 3、计数及结果分析 正常范围0.6-1.2 PCE/NCE评价细胞毒性的指标 受试物组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意义：受试化学物剂量过大，PCE形成受到严重抑制，实验结果不可靠 3.2 微核率：计数1000个PCE中含有微核的PCE数，以千分率（‰）表示. （若一个PCE中出现两个或两个以上微核，仍按有一个微核细胞计数）

五、操作步骤 3.3 阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，根据不同实验对象应与相关文献报道或研究历史数据相一致。 3.4 统计分析：选择合适的统计方法（Poinsson分布、二项分布、卡方检验等），试验组微核率与阴性对照组相比有显著差异时，可认为受试物为具有遗传毒性。

本次实验染毒处理（实验课前两天开始染毒）： 环磷酰胺腹腔注射 剂量：100mg/Kg 次数：两次染毒法（推荐多次染毒法） 注：由于实验条件与时间受限，本次试验只做环磷酰胺处理的阳性对照，目的是让大家看到微核并观察微核的形态。

取胸骨 擦净血污，剔去肌肉 小牛血清 混匀、推片 晾干 1分10秒 5min 30s，晾干 本次实验课要完成的试验步骤 剪去骨骺端 试剂一（蓝紫色） 试剂二（无色） 冲洗 细胞计数 1分10秒 5min 30s，晾干

六、注意事项（强调） 抓取小鼠时注意不要被抓伤或咬伤 骨髓液制备：迅速。在胎牛血清中迅速制取骨髓液。 涂片及染色：涂片均匀，防止细胞重叠 染色层次分明（染液用量、染色时间） 镜下观察：认真识别PCE和NCE 正确区分微核和涂片上的杂物 显微镜：骨髓涂片染色完成后，整理干净实验台，摘掉手套找魏老师领取显微镜并观察，禁止戴手套操作显微镜。正确使用显微镜，使用完毕用无水乙醇将油镜擦拭干净 整理实验用品，收拾试验台。

实验报告 实验目的 实验方法：简单叙述操作步骤 实验结果（要求计数200个红细胞，即NCE+PCE=200，计算PCE与NCE的比值。根据涂片质量数200个以上的PCE，计算微核率，如果片子做的不好无法计数计算，分析一下失败的原因。 ） 思考题：微核是怎么形成的？除了本次啮齿类动物骨髓细胞微核试验外，微核试验还有哪些？ 实验心得体会和改进 实验报告上交时间：下周三前 地点：公卫楼824 课件：通过邮箱发送

谢谢大家！