第一部分 微生物的利用 实验一 大肠杆菌的培养和分离

实验目的 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理

一. 基础知识 （一）微生物 （二）微生物培养基 （三）无菌技术 二. 微生物实验所需的操作技术 三. 大肠杆菌的培养和分离实验 四. 课题小结

1.1微生物 1.1.1微生物的特点 1.1.2微生物的种类 五类 1.1.3细菌的形态、结构和菌落 结构都相当简单，个体多数十分微小，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。且体内一般不含有叶绿素，不能进行光合作用 1.1.2微生物的种类 病毒界 病 毒 细 菌 原核生物界 五类 放线菌 真 菌 真菌界 原生动物 原生生物界 1.1.3细菌的形态、结构和菌落

1.1.3细菌的形态结构和菌落 1.1.3.1细菌的形态 1.1.3.2细菌的结构 1.1.3.3菌落 图1-1 常见的三种细菌典型形态 A.球菌 B.杆菌 C.弧菌 1.1.3.1细菌的形态 革兰氏染色：阳性或阴性，细胞壁成分不同 单细胞不分枝的原核微生物，细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察 1.1.3.2细菌的结构 基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中有液泡、储存性颗粒、核质等 附属结构：鞭毛、纤毛、荚膜、芽孢（抗逆休眠体）等 1.1.3.3菌落

1.1.3.3菌落 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落 细菌的菌落特征因种而异 菌落是鉴定菌种的重要依据 大肠杆菌 大肠菌群

1.2微生物培养基 1.2.1培养基的分类（按物理形态分） 1.2.2培养基所含的成分 培养基（培养液）是微生物生存的环境和营养物质 添加的琼脂量决定 细菌：用蛋白胨和酵母提取物配制 霉菌：用无机物或添加蔗糖的豆芽汁配制 （1）液体培养基（液） （2）半固体培养基 （3）固体培养基 1.2.2培养基所含的成分 （2）无机盐 （1）水 （3）碳源 含碳无机物或有机物，后者通常可作能源 （4）氮源 含氮无机盐或有机物，用于合成氨基酸等 细菌：中性偏碱（7.5~8.5） 霉菌：中性偏酸 （5.0~6.0） （5）生长因子 生长必需，而自身不能合成的化合物 通常用NaCl调节 不同微生物所需无机盐、碳源、氮源和生长因子的种类不同 培养基需要调节pH、渗透压、控制含氧量等条件

1.3无菌技术 1.3.1获得纯净微生物培养物的关键 1.3.2无菌技术 的四个方面 1.3.3消毒与灭菌 防止外来杂菌的入侵 （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行 （4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触 1.3.3消毒与灭菌

1.3.3.1消毒 常用消毒方法 使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物 一般不能杀死芽孢和孢子 煮沸消毒法 巴氏消毒法 常用于牛奶的消毒 化学药剂消毒法 酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外线消毒

1.3.3.2灭菌 常用灭菌方法和适用范围 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌 干热灭菌 在充分燃烧层灼烧 常用灭菌方法和适用范围 灼烧灭菌 微生物的接种工具 （接种环、接种针）或其他金属用具 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h 能耐高温的需要保持干燥的物品（ 玻璃器皿） 高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15—30min 最常用方式，通常用于培养基的灭菌及各种器具的灭菌

2.微生物实验所需的操作技术 2. 1器具的灭菌 2.2培养液（基）的配置、灭菌，放斜面和倒平板技术 2.3细菌的接种和纯化技术 不能用脱脂棉：易吸水后导致污染 2. 1器具的灭菌 棉花塞口 牛皮纸（或报纸）包口或包扎 121℃（1Kg/cm2）灭菌15min 60~80℃烘干 2.2培养液（基）的配置、灭菌，放斜面和倒平板技术 2.3细菌的接种和纯化技术 2.3.1平板划线法 简便，常用 2.3.2稀释涂布平板法 效果好

2.2培养液的配置、灭菌，放斜面和倒平板技术 2.2.1配置LB（Luria-Bertani，溶菌肉汤）培养基 配方 配制过程 计算、称量 蛋白胨：0.5g 酵母提取物：0.25g NaCl：0.5g 水：50mL 琼脂：1g（固体） pH：7.4～7.6 配制过程 混合加热 NaOHHCl 计算、称量 溶化 调pH（7．6） 三角瓶 试管 分装 三角漏斗分 通气；阻止微生物进入 高压蒸汽 1Kg/cm2，121℃， 15min 棉塞或封口膜 包扎 加塞 牛皮纸 灭菌 放斜面 倒平板 未凝固时 固体培养基

分装、放斜面、倒平板 分装 放斜面 倒平板 培养基不能沾上塞子、管口和管壁 易导致污染 固体分装试管，培养液不超过管高1/5 便于放斜面 液体分装三角瓶，一般培养基高度为瓶高1/4左右 本实验中，将50mL液体LB培养基和50mL固体LB培养基分别装入2个250mL三角瓶中，加封口膜（或棉塞） 放斜面 培养接种用菌种 固体培养基置于试管中灭菌后，斜靠在平放铅笔上，冷却 倒平板 超净台和双手消毒 点燃酒精灯创造无菌环境 倒平板操作

倒平板操作 倒平板操作中的问题讨论

倒平板操作中的问题讨论 （1）培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了 （2）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基 （3）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较大，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 （4）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物

2.3.1平板划线法 平板划线法操作中的问题讨论

平板划线法操作的问题讨论1 平板划线的具体方法 平板划线的具体方法 连续划线法 交叉划线法 2 1 3 1 2 3 4 60—70° 单菌落 交叉划线法 平板划线的具体方法 （1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束接种环上残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。 结束后要灼烧接种环以及时杀死残留的菌种，避免污染环境和感染操作者

一是划破后会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的 平板划线法操作的问题讨论2 （2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种 （3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 线条末端细菌的数目较少，这样操作能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落 （4）为什么平板划线时不能划破培养基表面？ 一是划破后会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落

2.3.2稀释涂布平板法 操作方法 梯度稀释 涂布分离 问题：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

3.大肠杆菌的培养和分离实验 3.1设备及用品 3.2实验材料 3.3实验过程 3.4课题成果评价 革兰氏阴性，兼性厌氧菌 灭菌锅或高压锅、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管（15mm×120mm）5支 3.2实验材料 （1）50mlLB液体培养基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl 0.5g、加水50ml （2）大肠杆菌菌种斜面 （3）空白斜面 3.3实验过程 3.4课题成果评价

3.3实验过程 细菌培养分离视频 固体 1.配制LB培养基 2.灭菌 3.倒平板 液体 LB液体培养基 LB固体培养基 各50mL，三角瓶 酒精灯旁操作 冷却成平板培养基 4个培养皿 4.接种扩大培养 1.培养基冷却 培养的大肠杆菌菌种 5.平板划线分离 2. 接种环烧灼 1.挑取单菌落菌种 6.单菌落接种 3. 接种环在菌种斜面培养基上冷却 2.斜面连续划线 4. 挑取菌种接种到液体培养基中 37℃培养24h 4℃保存 5. 37℃摇床震荡培养12h 6.菌种培养、保存

3.4课题成果评价 培养基的制作是否合格 接种操作是否符合无菌要求 是否进行了及时细致的观察与记录 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备 接种操作是否符合无菌要求 如培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习 是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯

4.课题小结 培养基类型 培养基 培养基的应用物质 避免杂菌污染的方法 无菌技术 实验室常用消毒法 实验室常用灭菌法 计算 大肠杆菌的培养和分离 称量 制备LB培养基 溶化 灭菌 倒平板 平板划线法 纯化分离 稀释涂布法 培养保存 斜面接种