银杏叶提取物脂质体片剂的制备 1、目的要求 2、实验流程 3、实验简介 4、实验原理 5、实验步骤 6、实验结果 吉林大学生物基础实验教学中心

目的要求 1.掌握乙醇注入法制备脂质体的工艺 2.了解喷雾干燥法的原理 3.掌握干法制粒压片的一般工艺 4.掌握多冲压片机的使用方法及片剂质量的检查方法 5.了解高效液相色谱检测方法的原理

实验流程 脂质体混悬液 分散性载体 喷雾干燥 脂质体粉末 干法制粒 脂质体片剂 片重差异 硬度试验 溶出度试验

实验简介 银杏叶 银杏科植物银杏Ginkgo biloba L的干燥叶。

银杏叶提取物 以银杏的叶为原料，采用适当的溶剂，提取的有效成分富集的一类产品。 银杏叶提取物主要包含两类化合物，即银杏黄酮和银杏内酯，在心脑血管疾病的预防和治疗方面有卓越的疗效和优越的安全性，用于癖血阻络引起的胸痹、心痛、中风、半身不遂，舌强语塞；冠心病稳定型心绞痛、脑梗塞等。具有多靶点多种成分协同作用。

银杏叶提取物制剂 我国和欧美发达国家在天然药物和保健食品中都常用。银杏叶虽有广泛的药理活性，但其有效组分银杏黄酮亲水性和亲脂性均差，口服难以吸收，生物利用度较低。 为了增加对银杏叶药效成分的吸收、提高生物利用度——脂质体

实验原理 一、脂质体 60年代初，Begkan等发现磷脂分散在水中可形成多层封闭囊泡，类似洋葱结构。 第一个上市用于皮肤病药品：益康唑脂质体凝胶于1988年瑞士Cilag制药公司注册 第一个上市用于治疗真菌感染的药品：注射液两性霉素B脂质体于1990年美国一家公司注册在爱尔兰上市销售 第一个抗癌药物脂质体——阿霉素脂质体：美国Sequus制药公司于1995年底在美国获得FDA批准

实验原理 1.脂质体定义 脂质体是利用磷脂双分子层膜所形成的囊泡包裹药物分子而形成的制剂。磷脂是双极性的，一头亲水，一头亲脂，亲水基朝外头，亲脂基朝内尾，2个磷脂分子“尾”部相对构成了一个双层分子结构。

当两亲性分子（磷脂）分散在水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露于水相，形成具有双分子层结构的封闭囊泡。在囊泡内水相和双分子膜内可以包裹多种药物，类似于超微囊结构。 这种将药物包封于类脂质双分子层薄膜中所制成的超微球形载体制剂，称为脂质体，一般由磷脂和胆固醇构成 见结构示意图

实验原理 2.脂质体原理 脂质体对细胞的作用机理：由于脂质体与细胞膜（生物膜）结构相似，脂质体的主要成份磷脂等类脂物也是细胞膜的主要成份，所以脂质体与细胞膜之间有很强的亲合力。脂质体的膜与生物膜融合，脂质体所包含的活性成份被释放而进入细胞内，或者整个脂质体被细胞吞噬，活性成份在细胞内被吸收。

实验原理 3.脂质体组成 脂质体系一种人工细胞膜，由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。 磷脂：天然磷脂（豆磷脂，卵磷脂等） 合成磷脂（二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱） 附加剂：胆固醇，也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体，其作用是调节双分子层流动性，减低脂质体膜的通透性。

实验原理 4.脂质体分类 小单室(层)脂质体：粒径在20～50nm，凡经超声波处理的脂质体混悬液，绝大部分为小单室脂质体；

实验原理 5.脂质体制备方法 5.1 薄膜分散法 一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理，得到小单室脂质体。特点是操作简便，但包封率较低。 5.2 反相蒸发法 制备多层脂质体或大单室脂质体的方法，此法包封率高。

实验原理 5.3 注入法 根据所用溶解磷脂的溶剂，可分为乙醚注入法和乙醇注入法。乙醇注入法是将磷脂、胆固醇和脂溶性药物及抗氧剂等溶于适量的乙醇中，在搅拌下慢慢滴入50～60℃水性溶液中，蒸去乙醇，即可形成脂质体。此法适于实验室小量制备脂质体。乙醇注入法制备脂质体，脂质体混悬液一般可保留10％～20％乙醇。

实验原理 5.4 冷冻干燥法 适于在水中不稳定的药物制备脂质体。 5.5 熔融法 适于制备多相脂质体，制得的脂质体稳定，可加热灭菌。 5.6 过膜挤压法 磷脂溶于有机溶剂中，脂溶性药物可加在有机溶剂中

实验原理 二、前体脂质体 1.定义 为了解决脂质体混悬液在贮存期间易发生聚集、融合、药物渗漏以及天然磷脂易氧化、水解等问题而提出的概念，系将脂质体膜材和药物的混合溶液在减压搅拌下逐步分布到一种可溶性固体载体表面，形成可自由流动的粉体状制剂。由于尚未形成脂质体混悬液，因此称之为前体脂质体，使用前加水或缓冲液水化即形成脂质体混悬液。

实验原理 2.前体脂质体制备方法 减压干燥法 流化床包衣法 冷冻干燥法 喷雾干燥法

实验原理 2.1 减压干燥法 常利用改进的旋转蒸发仪，使膜材与药物的混合溶液在减压旋转下逐步在固相载体表面形成一层磷脂薄膜，干燥后得流动性良好的前体脂质体颗粒。机理类似于薄膜分散法。需用有机溶剂；磷脂在载体表面的分布不均匀；操作较复杂；水溶性药物包封率低；脂溶性药物有较高的包封率。适用于蛋白质类药物、脂溶性药物。

实验原理 2. 2 流化床包衣法 载体、辅料粉碎过筛，与药物混合均匀或制粒，将脂质体和表面活性剂溶于有机溶剂后，用流化床转动，以切线喷方式喷于粉末或粒子表面，喷完后干燥，取出筛分得前体脂质体。机理为采用包衣材料磷脂对粉末进行包衣。可以大量制备口服或外用的前体脂质体粉末，问题是磷脂黏性较大，干燥过程较一般的包衣材料困难。

磷脂、药物及载体等成分溶解或分散到适宜的溶剂中，分装入西林瓶或安瓿瓶后，冷冻干燥成粉。可先制备脂质体，再经冻干制备。 实验原理 2.3 冷冻干燥法 磷脂、药物及载体等成分溶解或分散到适宜的溶剂中，分装入西林瓶或安瓿瓶后，冷冻干燥成粉。可先制备脂质体，再经冻干制备。 机理是水不经过液相而直接升华为水汽。制备过程中磷脂及药物均较稳定，但成本较高。适用于热敏性药物。

实验原理 2.4 喷雾干燥法 将膜材、附加剂及药物等溶解或分散在适宜溶剂中，经喷雾干燥制得粉末状前体脂质体。可先制备脂质体，再经喷雾干燥制备。 机理：机械作用雾化后，与热空气接触，水分迅速汽化。成本低，生产周期短。问题是操作温度较高，可能会引起磷脂和药物的氧化。适用于脂溶性和水溶性药物、中药提取物。

实验原理 2.4.1 干燥原理 将液态物料浓缩至适宜的密度后，使雾化成细小雾滴，与一定流速的热气流进行热交换，使水分迅速蒸发，物料干燥成粉末状或颗粒状的方法。

实验原理 2.4.2 基本过程 药液自导管经蠕动泵输送至喷头后，进入喷头的压缩空气将药液自喷头经涡流器利用离心力增速成雾滴喷入干燥室，再与热气流混合进行热交换后很快即被干燥。当开动鼓风机后，空气经滤过器、加热器加热至设定温度后，自干燥塔上部沿切线方向进入干燥塔，干燥塔内一般保持在120℃以下，少部分干燥的细粉落入收集器内，大部分干燥的粉末随热空气进入分离室后捕集于另一收集器中，热废气自排气口排出。

实验原理 喷雾干燥基本过程示意图

实验原理 2.4.3 优点 1）干燥过程非常迅速，几秒内结束； 2）干燥过程中液滴温度不高,产品质量较好； 3）喷雾干燥后产品不需进一步磨碎，简化工序； 4）喷雾干燥时，可以调节改变干燥条件而调整产品质量指标（如粉末的容积密度，粒大小等）； 5）产品具有良好的分散性，流动性和溶解性； 6）密闭且负压，保证了生产的卫生条件。

实验原理 2.4.4 缺点 1）体积传热系数小，单位产品耗热量大，热效率低； 2）设备体积庞大而复杂； 3）一次性投入较大； 4）干燥时物料易发生黏壁。

实验原理 三、片剂 片剂是应用最广泛的剂型之一，压片的工艺流程中各工序都直接影响片剂的质量。 1.优点:剂量准确、质量稳定、服用方便、成本低。 2.制片的方法：制颗粒压片 结晶直接压片 粉末直接压片 3.制颗粒的方法：干法和湿法。

实验原理 干法制料压片的工艺流程： 混合均匀 主药＋辅料（填充剂、粘合剂或崩解剂）----------→ 干法制粒 混合粉料--------------→ 干颗粒 ------------→压片

实验原理 颗粒的制造是制片的关键。 干法制粒，是将药物和辅料的粉末混合均匀、压缩成大片状或板状后，粉碎成所需大小颗粒的方法。该法靠压缩力使分子间产生结合力，其制备方法有压片法和滚压法。干法制粒压片法常用于热敏性物料、遇水易分解的药物，方法简单，省工省时。

实验原理 欲制好颗粒，首先必须根据主药的性质选好粘合剂或填充剂，药物与辅料的性质要相近，这样可以避免混合不均匀。因为物料的堆密度、粒度分布等物理性质相近时混合的均匀性才好，特别是当主药含量少的时候，成品需要做含量均匀度，如果混合不好问题就大了。 不溶性润滑剂最后加入。 注意：一定要等其他的敷料混合均匀后，再加入不溶性润滑剂，并且要控制好混合时间，否则会影响崩解和溶出。

实验原理 四、溶出度 1.定义 溶出度系指药物活性成分从片剂、胶囊剂或颗粒剂等制剂在规定条件下溶出的速率和程度。凡检查溶出度的制剂，不再进行崩解时限检查。药物只有固体制剂中的活性成分溶解之后，才能为机体吸收。溶出度试验能有效地区分同一药物制剂生物利用度的差异，是控制固体制剂内在的重要指标之一。

实验原理 2.测定方法 中国药典（2010年版）规定了3种测定方法，分别是篮法、浆法和小杯法。本实验采用的小杯法。仪器装置主要包括 搅拌桨、溶出杯以及浆杆与电 动机相连装置。 小杯法仪器装置

实验原理 搅拌桨 形状如图所示。浆杆上部直径为9.75mm± 0.35mm，浆杆下部直径为6.0mm±0.2mm；浆杆旋转时，浆轴与溶出杯的垂直轴 在任一点的偏差均不得大于2mm; 搅拌桨旋转时，A，B两点的摆 动幅度不得超过0.5mm。 小杯法搅拌桨结构

实验原理 溶出杯 由硬质玻璃或其他惰性材料制成的透明或棕色的、底部为半球形的250ml杯状容器，内径为62mm±3mm，高为126mm±6mm；溶出杯配有适宜的盖子，防止在试验过程中溶出介质的蒸发；盖上有适当的孔，中心孔为浆杆的位置，其他孔供取样或测量温度用。溶出杯置恒温水浴中或其他适当的加热装置。

实验原理 五、高效液相色谱 1.定义 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。

实验原理 2.特点 1）分离效能高 2）选择性好 3）灵敏度高 4）分析速度快 5）适用范围广(样品不需气化，只需制成溶液即可)

实验原理 3.分类 按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法。 按色谱原理不同可分为分配色谱法和吸附色谱法。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，如C18（ODS），它是在液-液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。

实验原理 4.分类 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

实验原理 5.系统组成 5.1 高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1）贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。

实验原理 2）流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈-水为底剂的溶剂系统。流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。 脱气的方法有：加热回流法、抽真空脱气法、 超声脱气法、在线真空脱气法等。

实验原理 3）高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。 对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。 高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。

实验原理 5.2 进样系统 1）手动进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（LOAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。

实验原理 2）自动进样器 具有操作方便、准确度高、自动控制、远程监控等特点。具有超大样品台，进行编程后，可在非人工监视下连续工作，进而提高了工作效率，减少了操作误差。

实验原理 5.3 色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称 ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅胶（C8柱）、氨基或氰基键合硅胶等，在中药制剂的定量分析中，主要使用ODS柱。由于ODS属于非极性固定相，在分离分析时一般使用极性流动相，所以属反相色谱法。常用流动相有甲醇－水或乙腈－水等，洗脱时极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱。

实验原理 5.4 检测器 在高效液相色谱法中主要使用紫外检测器（UVD），可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型，以可变波长紫外检测器应用最广泛。检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。

实验步骤 1 银杏叶提取物脂质体粉末的制备 1.1 试剂 银杏叶提取物、蛋黄卵磷脂、胆固醇、脱氧胆酸钠、甘露醇、无水乙醇 1.2 器材 恒温磁力搅拌器、超声波清洗器、铁架台、温度计、喷雾干燥仪、10mL注射器、100ml烧杯、50ml烧杯

实验步骤 1.3 处方 银杏叶提取物 200mg 脱氧胆酸钠 67mg 蛋黄卵磷脂 225mg 甘露醇 735mg

实验步骤 1.4 操作 1）药物相的配制：取处方量的银杏叶提取物和脱氧胆酸钠置于100ml烧杯中，加入去离子水50ml和乙醇5ml中，即得。 3）脂质体混悬液的制备：取药物相置磁力搅拌器上，加热至50~60℃，用10ml注射器吸取磷脂相，30s内注入到药物相中，保持温度继续搅拌10min，取下磁力搅拌器，即得。

实验步骤 4）待喷雾溶液的制备：向脂质体混悬液中加入处方量的甘露醇，常温搅拌10min使溶解，等待喷雾干燥。 5）喷雾干燥：安装喷雾干燥仪，调节进口温度为130℃，进料流量为450ml/h，进行喷雾干燥。喷雾干燥结束后，收集粉末，并称重。

实验步骤 2 银杏叶提取物脂质体片剂的制备 2.1 试剂 自制银杏叶提取物脂质体粉末、微晶纤维素、聚维酮K30 2.2 器材 干法制粒机、多冲压片机

实验步骤 2.3 处方 脂质体粉末 20g 微晶纤维素 1g 聚维酮k30 0.2g —————————————— (0.26g/片)

实验步骤 2.4 操作 称取脂质体粉末、微晶纤维素和聚维酮k30，混合均匀。加入到干法制粒机中，调节送料频率、压片频率和制粒频率，得到均匀性和流动性均好的干颗粒。计算片重，调节多冲压片机的填充量和片厚，进行压片。

实验步骤 3 银杏叶提取物脂质体片剂的检测 3.1 试剂 浓盐酸、色谱级甲醇、色谱级磷酸 3.2 器材 硬度计、脆碎度检测仪、溶出仪、数显控温电热套、提取回流装置、移液枪、高效液相色谱仪、

实验步骤 3.3 外观评价 应片形一致，表面完整光洁，边缘整齐，色泽均匀。 3.4 片重差异 取20片精密称定重量，求得平均片重，再称定各片的重量。按下式计算片重差异。 单片重-平均片重 片重差异＝——————————×100% 平均片重

实验步骤 药典规定，0.3g以下的药片的重量差异限度为±7.5％；0.3g或0.3g以上者为±5％。超出重量差异限度的药片不得多于2片，并不得有1片超过限度的1倍。本实验所制片剂重量差异限度按±7.5%规定。

实验步骤 3.5 硬度试验 用硬度计测试片剂的硬度，当片剂破碎时，记录硬度计显示的压力即为硬度。测3～6片，取平均值。能承受40～60N的压力即为合格。

实验步骤 3.6 溶出度试验 采用小杯法。以去离子水为溶出介质，超声脱气，取100mL置于浆杯中。待溶出介质温度恒定在37±0.5℃后，取银杏叶提取物脂质体片6片，置于浆杯中，设定转速100r/min，计时；分别在片剂放入前与放入后10、20、30、45、60min后取样，吸取溶出液5mL至250mL具塞锥形瓶中，同时向浆杯中补充相同体积的溶出介质。

实验步骤 向溶出液加入2ml浓盐酸和15ml甲醇，加热回流30min，待回流液降到室温后，置于25ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，混合均匀后，采用紫外-可见分光光度法在360nm进行测定。并计算药物在第10，20，30，45，60min的溶出度。

实验结果 1 外观 2 片重差异 3 硬度(kg) 4 溶出曲线

脱氧胆酸钠作用： 以支撑磷脂双层膜（supponed bilayer lipid membrane，s-BLM）作为生物膜模型，采用循环伏安法和交流阻抗技术研究了脱氧胆酸钠（sodtum deoxycholate，NaDC）与s-BLM的相互作用．结果表明，NaDC能降低磷脂分子的有序性，诱发s-BLM上形成孔洞或缺陷，并且它们之间的这种相互作用对作用时间、NaDC溶液的浓度和pH值以及胆固醇的存在与否具有依赖性，并且作用后的s-BLM在0．1mol／L的KCl溶液中能够自我修复，这表明NaDC与s-BLM的相互作用是可逆的．

甘露醇对脂质体体外具有稳定作用 增加脂质体体外稳定性的实验研究, 分别选用了甘露醇加聚乙烯硫酸酯(Poeylinyl Sulfate,简称PVS)、右旋糖苷、猪肝胞质RNA作为脂质体的稳定因子。通过4℃冰箱存放至100天或用丙酮—干冰低温加速破坏后经电镜观察以及超滤法除去凝聚,融合的大颗粒放射性脂质体等方法均显示,只要脂质体溶液中存在甘露醇—PVS,其脂质体的形态及残留于超滤膜上的放射强度测定均较生理盐水对照组及其它各组稳定。 经统计学处理有显著性意义,P值小于0.05或0.01。