丙型肝炎实验诊断研究进展 山东省临床检验中心 卢志明 丙型肝炎实验诊断研究进展 山东省临床检验中心 卢志明

丙型肝炎病毒 1、有包膜,属黄病毒科，丙型肝炎属。 2、单股正链 RNA (9.6 kb) 3、T½: 2.7 小时 4、每日复制量：10 兆 (1012) 病毒颗粒 Slide 2. HCV 的特征 HCV具有与黄病毒科病毒相似的病毒学和遗传学特征[1] 。HCV RNA被一层具有保护作用的“外衣”包裹，这种“外衣”是由蛋白质组成的，又称为核衣壳。HCV呈球形，有包膜，直径约50nm，半衰期（T1/2)约为2.7小时[2]。未经治疗的HCV感染者，其体内每天产生和清除的病毒可达10万亿个（即1012）[2]。 在结构上，HCV基因组为连续的、线性、单股正链RNA病毒[1] 。基因组长度约9.6kb，编码一种由3000个氨基酸残基构成的多聚蛋白[3]。 HCV 具有高度的异质性，至少有6种已知的基因型(基因型1～6）和众多亚型（大于80种) [4]。此外 ，在HCV感染个体，其体内的HCV是由密切相关，但又不相同的病毒群，即准种构成[1，5]。 HCV极易发生变异，由此产生的HCV准种和包膜蛋白的改变，使HCV易逃避宿主的免疫监测[6]。   1. Purcell RH. NIH Consensus Conference on Hepatitis C. 1997. 2. Neumann AU et al. Science. 1998;282:103-107. 3. Rosenberg S. J Mol Biol. 2001;313:451-464. 4. Fang JWS et al. Clin Liver Dis. 1997;1:493-514. 5. Hepatitis C Council of South Australia Inc. Hepatitis C genotypes. 6. Hoofnagle JH. NIH Consensus Conference on Hepatitis C. 1997. Purcell RH. NIH Consensus Conference on Hepatitis C. 1997. Neumann AU et al. Science. 1998;282:103-107. Rosenberg S. J Mol Biol. 2001;313:451-464. Lauer GM, Walker BD. N Engl J Med. 2001;345:41-52.

HCV的病毒命名 从非甲非乙型肝炎到丙型肝炎: 1968-1974年间,HAV、HBV诊断方法相继建立,人们发现还有一种引起输血后肝炎的致病因子. 1974年纽约的Pince对204例术后病人随访,6个月51人(25%)发生了输血后肝炎,仅12人与HBV有关.CMV显然不是输血后肝炎的原因. 1989年9月在东京会议上命名此种病毒为丙型肝炎病毒(HCV),由此引发的肝炎称之为丙型肝炎(HC).

HCV基因组结构 HCV为单股正链RNA病毒 5`NC区、3`NC区为非编码区 5`NC与3`NC间分结构编码区：C区、E1、E2；非结构编码区：NS1~5 5`NC区最保守，C区较保守，E2／NS1有高变区（HVR1）

表 HCV表达蛋白的特性和功能 基 因 氨基酸数目 抗 原 功 能 C E1 E2 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b 基 因 氨基酸数目 抗 原 功 能 C E1 E2 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b 191 192 327 316 631 54 261 448 591 C22-3 Gp33 Gp70 G33c C100 NS5 核壳蛋白,高度保守 糖膜蛋白,在不同基因中高度变异 金属蛋白酶 蛋白酶和螺旋酶 不清楚 复制酶 RNA依赖的RNA聚合酶

全球丙肝的流行情况 2、急性HCV感染者中8O-90％可发展为慢性肝炎,其中约20-30％会缓慢进展为肝硬化。1-5％发展为肝癌。 1、WHO的资料表明,全世界已有约1.7亿丙型肝炎病毒感染者。 2、急性HCV感染者中8O-90％可发展为慢性肝炎,其中约20-30％会缓慢进展为肝硬化。1-5％发展为肝癌。 3、HCV主要经血液和血液制品传播。 至今还没有预防丙型肝炎的疫苗问世,治疗效果不是十分理想。因此,建立一种针对HCV的具有高灵敏度、特异性和稳定性的检测方法，对于防止HCV传播、HCV感染的早期诊断和治疗具有重要意义。

我国丙型肝炎流行情况 一般人群抗-HCV流行率: 3.2% 估计HCV感染人数: 3 800万 目前经过血源的管理，丙肝发病率应当有所下降， 但有大量病人未被发现和治疗 ( 全国病毒性肝炎血清流行病学调查 1992~1995 )

我国各省市自治区HCV抗体 流行率 >3%( 14 省) 2～3%( 11 省) <2%( 6 省) 黑龙江 吉林 内蒙古 辽宁 新疆 辽宁 甘肃 北京 天津 河北 宁夏 山西 青海 山东 陕西 河南 江苏 西藏 安徽 上海 湖北 四川 重庆 浙江 >3%( 14 省) 江西 湖南 贵州 福建 2～3%( 11 省) 云南 广东 台湾 广西 <2%( 6 省) 海南 ( 全国病毒性肝炎血清流行病学调查 1992~1995 )

我国HCV基因型调查 1、HCV 1b型是主要的基因型，其检出率达83.17％。 2、HCV 2型检出率低，占6.86％；其余为1b、2、4b型的混合型。 3、HCV 1b检出率在<30岁、30～49岁、>50岁组分别为77.77％、83.92％、90.90％。 4、HCV 1b在女性感染的比率较高（93.61％），男性为75％，差异有极显著的统计意义(p<0.01)。 5、HCV 1b型在感染时间>10年和<10年病人中的检出率分别为100％和80.43％（p<0.01） 。

HCV 感染：中国 HCV 基因型的地理分布 HCV基因型在中国的分布以1b型为主，2a型为辅助 长沙 佳木斯 沈阳 北京 哈密 兰州 南京 Jiamusi Shenyang Beijing Hami Lanzhou Chengdu Nanning Nanjing 佳木斯 沈阳 北京 哈密 兰州 成都 南京 南宁 II/1b III/2a II/III 6 a Wang Y, et al. J Med Viral, 1993,40:254-260 庄辉，等. 中华流行病学杂志, 2001,22:99-101 ● 长沙

肝脏疾病终末期，肝细胞癌，肝脏移植，死亡 HCV感染的自然史 100 位 HCV 急性感染 80% 持续感染 20% 痊愈 30% 稳定，慢性，无进展 40% 有不同程度进展 30% 呈严重进展 肝脏疾病终末期，肝细胞癌，肝脏移植，死亡 Adapted from Alter HF, Seeff LB. Semin Liver Dis. 2000;20:17-35

丙型肝炎病毒(HCV)感染危害性不容忽视 全球性流行 —— 3% (1.7 亿) 慢性化的危险性 —— 60%–85% 临床诊断病例 —— < 30% 肝硬化的危险性 —— 在感染后20年内达 10% 在感染后30年内达20% 肝硬化患者中肝细胞癌 —— 1%–4%/年 (美国) 的发生率 ~ 7% (日本、台湾) 失代偿肝硬化10年存活率 —— 25％ 肝硬化相关性病死率 —— 1%–5%/年 WHO. Hepatitis C. Fact sheet no. 164. Emmet B. Keeffe, MD, Medscape Gastroenterology eJournal, 2002, 4(2) National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002 Consensus statements on the prevention and management of hepatitis B and C in the Asia-pacific region

HCV的感染人数 = 临床病例？ 发病隐匿 基层临床医生认识不足 丙肝检测没有纳入常规查体项目 确诊比较难，费用高 抗体的窗口期，RNA的假阴性** ——临床诊断病例少

问题与挑战 挑战!! 高感染率、低诊断率 高慢性化率 美国： 在2015年以前，临床诊断HCV的成人病例数增加4倍 中国： 挑战？！ 无有效疫苗预防 认识不足 National Institute of Health Consensus Development Conference Statement: Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002

我 们 如 何 应 对 挑 战？ 1、制定中国丙肝防治指南：规范丙肝的筛查， 诊断和治疗。 2、加强丙肝疾病和诊疗对基层医生的教育。 3、重视临床一线对丙肝的筛查。 4、通过各种途径提高公众对丙肝的防范意识： 如媒体等。

近年来丙肝研究进展 丙肝分型、病毒复制、病毒变异等 慢性化机制、脂肪变性、癌变机理等 抗病毒治疗：I型应答率40%；II型应答率80% 特异性靶向抗病毒治疗（2期临床）

实验室诊断进展 多抗原包被的抗体检测（第3代抗-HCV） HCV-Ag的检测（第4代） 抗原-抗体联合检测（筛查） HCV的基因分型 HCV-RNA的检测 ——总之，实验室诊断研究进展？

实验室诊断方法 诊断、监测 方法 HCV-RNA定性试验PCR、TMA HCV血清学试验 HCV-RNA定量试验PCR、bDNA EIA检测HCV抗原 HCV-RNA定量试验PCR、bDNA 诊断、监测 方法 HCV血清学试验 EIA检测抗HCV 基因分型 ALT 肝活检 肝纤维化非损伤试验 National Institute of Health Consensus Development Conference Statement: Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002

常用的检测方法 酶联免疫吸附试验-HCV抗体检测 酶联免疫吸附试验- HCV核心抗原检测 免疫学方法-免疫印迹法（RIBA） 免疫学方法-血清学分型 分子生物学方法-HCV-PCR定量、HCV-PCR定性 分子生物学基因分型方法-型特异PCR分型法、型特异探针杂交法、限制性长度多态性分析法(RFIJP)、核酸序列分析法、酶切分型法、基因芯片等

感染丙肝病毒后各指标检测时间表 Analyte Level 100 80 60 40 20 Time Anti- HCV HCV- RNA Anti-HCV Window = 70 days(3rd Gen) = 82 days(2nd Gen) 100 80 60 40 20 Analyte Level Time HCV RNA Window = approximately 11~13 days Anti- HCV HCV- RNA HCV Ag Window = 12~14 days HCV- Ag 清学分型

感染丙肝病毒后各指标检测时间表 Analyte Level 100 80 60 40 20 Time Anti- HCV HCV- RNA Anti-HCV Window = 70 days(3rd Gen) = 82 days(2nd Gen) 100 80 60 40 20 Analyte Level Time HCV RNA Window = approximately 11~13 days Anti- HCV HCV- RNA HCV Ag Window = 12~14 days HCV- Ag 清学分型

HCV抗体检测应用的不足 目前国内主要应用抗HCV/EIA检测抗体，经抗体筛选后，临床上仍有少量的输血后丙肝的发生。 主要原因 窗口期

丙肝抗体假阴性问题 1.窗口期 2.静默感染 (immunosilent infection) 3.试剂质量 4.其它

HCV抗体检测应用的不足 1、不能用于丙型肝炎的早期诊断。 2、临床上不能区分既往感染和现症感染。

血清HCV-RNA的检测 血清HCV-RNA的定性检测： 容易产生假阳性或假阴性（PCR产物易产生污染） 血清HCV-RNA的定量检测： 优点：可用于抗病毒治疗的选择与疗效监测

免疫学方法-免疫印迹法 重组免疫印迹法(Recornbinant immunobIot， RIBA)RIBA是FDA批准的抗HCV补充试验．主要是 解决ELISA试验中的假阳性问题。 目前广泛使用的RIBA一3非特异性反应明显减少，敏感度显著提高(99．5）。 缺点是RIBA在操作上较ELISA困难，费时、成本 高，因此限制了这项技术在临床上的普遍使用。

目前检测方法 抗-HCV and HCV-RNA的检测 ——不能满足临床早期、准确、可靠的要求。 RIBA实验操作复杂、费用较高、推广难

丙肝抗原检测 1、丙型肝炎早期感染诊断指标 2、丙型肝炎确诊指标 3、丙型肝炎治疗评价指标 4、丙型肝炎筛查指标

HCV核心抗原的检测 HCV 感染过程 诊断用 早期检测 “筛查” 时间 年 日 “总”抗原 “总”抗原 (抗体结合) “游离”抗原 时间 年 12-14天 70-80天 日 1 pg/ml 总HCV 核心抗原 = 8000 IU/ml HCV RNA

感染丙肝病毒后各指标检测时间表 HCV RNA “总”抗原 灵 敏 抗-HCV 度 早期检测 “筛查” “游离”抗原 60 HCV RNA 50 “总”抗原 灵 敏 度 40 抗-HCV 30 早期检测 “筛查” 20 “游离”抗原 10 时间 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 天 ■HCV RNA 11~13 days ■ HCV Ag 12~14 days ■ Anti-HCV = 70 days(3rd Gen) = 82 days(2nd Gen) 1 pg/ml 总HCV 核心抗原 = 8000 IU/ml HCV RNA

检验原理 通过对血清或血浆样品进行预处理，解离HCV抗原/抗体复合物并释放出所有核心抗原，经固相包被特异性抗体捕获后，再与酶标记抗体形成双抗体夹心复合物，最后加入酶底物显色，以产品规定的可见光波长临界OD值判断HCV抗原检测结果。

HCV抗原ELISA基本原理 抗HCV抗体-HRP HRP 抗HCV体 样本处理 抗 原 HCV抗体 酶 联 板

不同亚型丙型肝炎病毒核心抗原的序列分析 10 20 30 40 50 60   HCV 1 MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG HCV 1b MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG HCV 2a MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG HCV 2b MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG HCV 3 MSTLPKPQRK TKRNTIRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYVLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG   70 80 90 100 110 120 HCV 1 RRQPIPKARQ PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG HCV 1b RRQPIPKARQ PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG MGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRHRSRNLG HCV 2a RRQPIPKDRQ STGKSWGKPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPTWGPT DPRHRSRNLG HCV 2b RRQPIPKDRQ STGKSWGKPG YPWPLYGNEG LGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNVG HCV 3 RRQPIPKARQ SEGRSWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG 130 140 150 160 HCV 1 KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGARRA LAHGVRVLED HCV 1b KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGARRA LAHGVRVLED HCV 2a KVIDTLTCGF ADLMGYIPVV GAPVGGARRA LAHGVRVLED HCV 2b KVIDTLTCGF ADLMGYIPVV MAPLGGARRA LAHGVRVLED HCV 3 KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV MAPVGGARRA LAHGVRALED

四株单抗亚型检定 2号(CAb-2) IgG2a 1号(CAb-1) IgG2a 3号(EAb-1) IgG2b

HCV-Ag和HCV-RNA检测的比较 HCV cAg HCV RNA 样本储存的条件要求 普通 特殊 样本的前处理试剂 不需要 需要 样本储存的条件要求 普通 特殊 样本的前处理试剂 不需要 需要 特殊仪器要求 无 有 实验人员的训练 普通 专业 实验费用 低 高 根据我国目前的状况,HCV cAg检测更符合我国的国情,可 以为血液安全,临床诊断提供廉价,切实可行的检测方法.

丙肝抗体检测“窗口期”补充方案 1.检测丙肝抗原 2.检测丙肝病毒RNA 3.联合检测：HCV Ag + HCV RNA + HCV Ab

HCV实验室检测流程 RR阳性 EIA S/CO >3.8 ECi S/CO > 8 阴性 报告 报告 HCV-Ag HCV-Ab RR阳性S/CO比值<3.8 ECi S/CO < 8 HCV-Ab RIBA HCV RNA NAT 或 阴性 阳性 报告 阴性 可疑 阳性 报告 报告 报告 其他结果评价 (如NAT、ALT)

丙肝确诊后的实验室检测 HCV基因分型——选择抗病毒治疗防案、疗效评价、确定疗程，预后判断 HCV-RNA定量的检测——评价抗病毒治疗的疗效 丙肝抗原定量检测——即将上市，评价抗病毒治疗的疗效

HCV实验结果临床诊断分析 急性丙肝 HCV RNA(+) (-) HCV Ab量由高 低 HCV RNA 持续 (+) HCV Ag (+) (-) HCV Ab量由高 低 HCV RNA 持续 (+) HCV Ag 持续 (+) HCV Ab 持续 (+) 支持自身清除 (15--20%) 急性丙肝 支持发展慢性丙肝 (80--85%)

HCV实验结果临床诊断分析 慢性丙型肝炎 慢性丙型肝炎 慢性肝病患者： HCV RNA (+) HCV Ag (+) 抗HCV (+) 对免疫健全的HCV RNA(+)患者,其中HCV抗原、抗HCV (EIA) 阳性率 > 99% 对某些透析或严重免疫缺陷患者, 尽管存在HCV RNA 复制, 但抗HCV (-), 可诊断为HCV感染者或慢性丙肝患者 慢性丙型肝炎

HCV实验结果临床诊断分析 献血员或体检群体的筛查 若抗HCV(+), HCV Ag(+), HCV RNA(+) 为 “ 窗 口 期 ” (70天) “静默感染” (immunosilent infection) 是引起输血后丙肝的主要原因

总 结 1、丙肝是引起肝硬化、肝癌的主要原因之一，是危害人民生命健康的严重疾病，应引起临床医生的高度重视。 总 结 1、丙肝是引起肝硬化、肝癌的主要原因之一，是危害人民生命健康的严重疾病，应引起临床医生的高度重视。 2、丙肝抗原的检测是抗-HCV窗口期及HCV-RNA假阴性的补充，丙肝抗原的定量检测是抗病毒治疗的评价指标。 3、丙肝无疫苗预防，起病隐匿，丙肝抗原、抗体的联合检测应成为常规临床检查项目，及早发现潜在病人。 4、HCV分型、HCV-RNA检测是选择抗病毒治疗方案、疗效评价、确定疗程，预后判断的重要指标。

谢谢！