组织工程 深圳大学生命科学学院　张小云

一、组织工程基本概念及发展概况 组织工程学的内涵 组织工程学的发展 组织工程学研究展望

1.1组织工程学的内涵 组织工程学是综合应用工程学和生命科学的基本原理、基本理论、基本技术和基本方法，在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，修复组织缺损，替代组织、器官的一部分或全部功能，或作为一种体外装置，暂时替代器官部分功能，达到提高生活、生存质量，延长生命活动的目的。 这一内涵的核心是活的细胞、可供细胞进行生命活动的支架材料以及细胞与支架材料的相互作用，这是组织工程学研究的主要科学问题。 一旦在体外能成功地制造出“组织”或“器官”，则通过医生的创造性劳动，将“组织”、“器官”植入人体，完成复制或修补人体组织、器官的艺术创作。

1.2组织工程学的发展 组织工程学的提出、发展不是偶然的，与很多因素有关： ①随着人类物质、文化生活水平的提高，对损伤、疾病的治疗要求越来越高，不仪要求治好伤、病，还要求良好的功能及完美的外形，应用传统的治疗方法难以达到如此完善的地步，需要寻找新的治疗途径。 ②科学技术总体水平的提高，为患者、医生对治疗提出的高要求有实现的可能，如完善的细胞培养技术和可控降解的高分子材料的问世，为体外构建“组织”、“器官”提供了条件。

③高、新技术的开发与利用是组织工程学研究的基础，如基因工程技术、免疫隔离技术等为改造细胞提供了新方法。 ④巨大的市场需求为组织工程学发展注入了动力。众多的投资公司注入大量资本进行组织工程学研究。这些是组织工程学研究发展的基础与动力。

1.3组织工程学研究展望 在组织工程学研究兴起的10多年时间里，由十广大科学工作者的艰苦努力，已取得了十分可喜的成绩。 然而人体具有极为复杂的大体及微观结构，十分完善的功能体系，非常精密的调节系统，永不停息的新陈代谢活动等，在组织工程学研究中还隐藏着很多未知的奥秘，要完全模拟在人体组织或器官，并非易事，这需要生物学、工程学、材料学、化学、基础医学、临床医学和生物医学工程学等多学科交叉，有机结合，共同攻关，逐一解决组织工程学研究中的科学问题。

组织工程学研究的科学问题 A 种子细胞的研究。 B 支架材料及细胞外基质的研究。 C 体内植入研究。 D 检测方法及检验标准。 E 临床验证研究。 F 产业化研究。

A 种子细胞的研究 自体、异体、异种各种组织细胞的分离培养技术，细胞生物学行为，多种细胞的复合培养技术； 细胞因子的有序作用、信息传递及其调控； 建立实验标准细胞系，改造种子细胞，延长细胞寿命及生存期； 改变细胞表面结构，研究细胞粘附及抗粘附力的技术及其影响机制； 研究降低细胞抗原性及增强宿主免疫耐受的方法。

干细胞研究 干细胞研究受到科学家和世人的广泛关注有其必然性，干细胞在生命科学的基础研究与临床应用中起着越来越重要的作用，干细胞在细胞治疗、组织器官修复等领域有着极为广阔的应用前景。 可作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞。干细胞的研究与应用将有可能使人类实现完美修复损伤组织和器官的梦想。利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植的来源将成为干细胞应用的主要方向。

干细胞的定义 干细胞(stem cell)是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞。 根据这一定义，在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞，只是随着年龄的增长，干细胞的数量逐渐减少，其分化潜能也逐渐变窄。 在干细胞的发育过程中，还有一种中间类型的细胞称为祖细胞(progenitor cells)，祖细胞也具有有限的增殖和分化能力，与干细胞不同的是，祖细胞没有自我更新能力，它在经过几轮细胞分裂周期后产生的两个子代细胞均为终末分化细胞(terminal differentiated cells)

T细胞 血小板 浆细胞 巨噬细胞 中性粒细胞 嗜曙红细胞 肥大细胞 红细胞

干细胞的分类 根据发生学来源分类。 根据分化潜能分类。 根据干细胞组织发生的部位进行分类。目前，已经从许多组织或器官中成功地分离出干细胞，其中包括：胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、成骨于细、内胚层干细胞、视网膜干细胞及胰腺干细胞等。

根据发生学来源分类 按照发生学来源，干细胞可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(somatic stem cell)。

胚胎干细胞 胚胎干细胞是指由胚胎内细胞团(inner cell mass，ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cell，PGC)经体外抑制培养而筛选出的细胞。 胚胎干细胞还可以利用体细胞核转移(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术来获得。 胚胎干细胞具有发育全能性，在理论上可以诱导分化为机体中所有种类的细胞；胚胎干细胞在体外可以大量扩增、筛选、冻存和复苏而不会丧失其原有的特性。

成体干细胞 成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。 成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。 成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。

根据分化潜能分类 根据不同的分化潜能，干细胞可以被分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stem cell)、单能干细胞(unipotent stem cell)。

全能干细胞 具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，有形成完整个体的分化潜能。 如胚胎干细胞，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。

多能干细胞 多能干细胞具有产生多种类型细胞的能力，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。 例如，造血干细胞可分化出至少12种血细胞，骨髓间充质干细胞可以分化为多种中胚层组织的细胞(如骨、软骨、肌肉、脂肪等)及其他胚层的细胞(如神经元)。 科学家们目前趋向于将分化潜能更广的干细胞称为多潜能干细胞(pluripotent stem cell)，如骨髓间充质千细胞，而将向某一类型组织的不同细胞分化的干细胞称为多能干细胞(multipotent stem cell)，如造血干细胞、神经细胞等。

单能干细胞(也称专能、偏能干细胞) 常被用来描述在成体组织、器官中的一类细胞，意思是此类细胞只能向单一方向分化，产生一种类型的细胞。 在许多已分化组织中的成体干细胞是典型的单能干细胞，在正常的情况下只能产生一种类型的细胞。 这种组织是处于一种稳定的自我更新的状态。然而，如果这种组织受到伤害并且需要多种类型的细胞来修复时，则需要激活多潜能干细胞来修复受伤的组织。

干细胞的分离纯化基本思路 解离组织制备细胞悬液 利用细胞体积和密度进行分离和纯化 选择性的细胞凝集/形成玫瑰花结 基于不同黏附特性的细胞分离 利用细胞表面标志分离纯化细胞，如免疫溶解法；流式细胞分选术；平面黏附分离法；免疫要、磁珠分选技术

干细胞的冻存和复苏 选择合适的冻存速率 加入冷冻保护剂 低温保存液的研究 细胞浓度对冻存效果的影响 复温速度宜快，通常在37℃中水浴 解冻后洗涤清除冻存保护液和保存液

干细胞研究中的主要问题 维持胚胎干细胞未分化状态的机制 干细胞定向诱导分化的调控机制 获得高数量和高纯度的分化细胞，为组织工程提供种子细胞 虽然人胚胎干细胞可以形成各种类型的细胞和简单的组织，但是其是否具有形成复杂器官的能力目前还远未清楚。 来源于胚胎干细胞的细胞应用于细胞和组织替代治疗所面临的移植排斥问题 干细胞用于临床治疗的安全性问题，对于胚胎干细胞而言，在移植前应该保证胚胎干细胞全部被诱导分化，对诱导分化的细胞应该严格纯化 干细胞可塑性的机制是怎样的，干细胞分化时所处微环境中的调控因素是如何起作用的

细胞周期 人的细胞周期一般被传统的分为有丝分裂期和分裂间期。 分裂间期细胞理论上有两类：一类直接进入另一个细胞周期，为下一次分裂作准备；另一类则长期处于分裂间期，表达该细胞的功能产物。 细胞的有丝分裂必须经过细胞质和细胞核的复制阶段。因此，一个细胞周期可按此标准划分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有丝分裂期(M期)。

细胞的分裂与生长调控 人体细胞总是都处于一个动态平衡的环境中。人体生长发育最重要的基础是细胞的分裂增殖和细胞的成熟。当个体发育结束后，人的各细胞群均处于一个相对稳定的数量，发挥其生理功能。 组织工程的细胞也要经过分裂增殖，大量增加细胞数目，并稳定在能满足功能需要的数量上，然后植入体内，发挥其生理功能。在这一工作中，了解培养细胞的分裂增殖规律，利用这些规律调控细胞的生长状态是十分重要的。

培养细胞的传代周期 生活在同一个培养容器中的细胞群体，由每一个细胞的生命周期的集合，构成了这一群体细胞在这一培养容器内的生长曲线。这些细胞称为一代，生长曲线就是这一代细胞的周期。这一代的周期结束就必须传代，进入下一个周期，否则正常细胞就会发生成片死亡等现象。 细胞的传代周期可分为潜伏期、对数增殖期和平顶期。

培养细胞的生存期 培养细胞的生存期指细胞在连续传代情况下生存的时间，一般用能传多少代表示。它包括原代培养期、传代培养期和衰退期。正常细胞都有有限的生存期。如培养的肌腱细胞生存期为13代，软骨细胞为6代，成纤维细胞能传50代。细胞到生存期的末代，表现出细胞生长缓慢或不增殖甚至死亡。因此，若要保存某细胞，则要在该细胞传代培养的旺盛时期进行冻存。目前世界上常用细胞均在10代内冻存。 另一种保存细胞某种特性的方法是在细胞衰退前对细胞进行转化。转化细胞可形成无限细胞系，但需注意转化后是否还保留了所需特性。

加快细胞增殖的方法 织工程在获得理想细胞以前需用自体细胞与材料复合，构建组织工程的初级产品。在这一过程中面临的最大问题是细胞增殖缓慢。 目前解决这一问题有两条途径，即具有分化潜能的细胞的诱导和促生长因子的应用。 在体内情况下，多种生长因子都由机体协调作用，因而是一个多因子序贯作用体系：体外如何模仿实施这一多因子序贯调节将是组织工程的另一重大课题。

体外培养细胞主要环境影响因素 细胞生长与生存微环境的关系 功能细胞与支持细胞的相互关系 功能细胞与其支持物——ECM的关系 功能细胞的生长繁殖与三维空间的关系 功能细胞的生长繁殖与应力等物理因素的关系

体外培养细胞与体内细胞存在的主要差异 由于体外模仿的技术尚不十分完善，因此目前培养细胞与体内细胞仍然存在着差异。 按照组织工程的需要，可将差异分为两类：功能差异和生长、增殖差异。

功能差异 细胞体外培养的功能差异指在体外培养条件下，细胞降低甚至丧失了其在体内的合成、分泌等功能，即细胞的分化特性减弱或不显。 细胞在培养条件下的功能降低和丧失对组织工程研究影响十分巨大。因为如果复合的细胞没有其特定功能，则注定不能发挥其应有作用，亦无法构建真正的活材料。因此，必须在改善体外细胞培养环境方面不懈努力，使目的细胞保持其特有的功能。

增殖差异 细胞体外培养的生长、增殖差异指在体外培养条件下，细胞在生长方式、移行方向、增殖能力等方面的改变。 体内绝大多数功能细胞是高分化细胞，或称特化细胞，某一功能高度发达而其他分化潜能相对丧失的细胞，通常代谢相对缓慢，不增殖或增殖十分缓慢，如肌腱细胞。在体外培养条件下，这些不增殖或增殖缓慢的细胞都可以在培养基中成倍的增长甚至传代，这无疑给组织工程大量繁殖细胞带来了方便。

体外培养细胞与体内细胞产生差异的原因 各种不同的细胞通过特定的方式集合成为组织，再构成器官及机体。每一个细胞在这一体系中均受到统一的神经体液调节和细胞间的相互作用。 当细胞被分离，置于体外后，失去了机体的神经体液调节：同时，细胞从其附着物上游离后，组织中多细胞协同变成了培养中的单一细胞接触，因而细胞间的相互作用亦发生了改变。这一系列细胞生存外部条件的改变必然导致细胞的生物学、行为的改变。 众多细胞培养实践表明，细胞生物学形态改变程度取决于细胞生存环境因素改变的大小，即体外培养环境模仿体内的程度。培养条件越接近，则细胞的生物学行为越接近体内细胞。因此，目前在组织工程研究过程中必须进一步弄清体内每一种细胞的关系。

体内外细胞增殖分化的差异与组织工程的关系 细胞的增殖和分化是细胞生命进程中所获得的基本属性。增殖使细胞数量增多，分化使机体结构和功能多样化，表现在细胞与细胞之间呈现高度的相互依存性和个体细胞相对失去独立性。 细胞由体内移至体外培养，在适宜的条件下，其增殖能力得以提高，同时由于人为控制条件，细胞的分化功能得以保留，这是组织工程构建活材料的基础。 要细胞保持其功能就必须尽可能地模仿体内环境，在保持细胞功能的基础下，为了适应组织工程的需要，还需不断摸索新的培养方法，使细胞增殖更快，并且在应力等物理条件下三维生长，以达到构建活材料的目的。

细胞的三维培养 组织细胞在体内所处的化学和物理环境非常复杂，完全不同于体外普通的单层细胞培养。 细胞的三维培养是指细胞在模拟体内细胞的化学、物理和生物学条件下，在三维基质支架中进行培养。 这种模拟在体细胞生长、分化及代谢的离体研究手段广泛用于组织工程研究中。

细胞三维培养的一般方法 种子细胞的制备。 细胞外基质支架的制备。 三维培养。

细胞三维培养在组织工程中的应用 细胞隔离和替代；只有那些提供需要的细胞才允许被替代。细胞需要浸入浴液处理，以保持它们在接受者体内的功能以及排斥免疫。 组织替代；组织替代取决于特定信息分子(促进细胞生长、分化和增殖的调节因子等)的提纯和大规模生产，并将这些信息分子输送到位的方法。 细胞置于基体表面或位于基体中；在封闭系统内，细胞通过一层膜与身体隔离，这层膜允许营养物质和废弃物渗透，但阻止尺寸较大的抗体和免疫细胞来消化这个植入体。

细胞的复合培养 从根本上说，细胞的复合培养也是细胞的三维培养，只是其种子细胞是多种细胞的复合。 基质细胞包括其他的疏松结缔组织细胞，在细胞复合培养中充当“饲养”细胞的作用。基质提供复合培养的支架，种植并生长于其中的基质细胞分泌生长因子，以保证种子细胞增殖并使细胞培养长期维持。 基质细胞发生增殖、生长及分泌生长因子，形成类似于在体组织的基质成分。复合培养中基质细胞的三维生长保证了种子细胞的活性增殖。

应力对细胞生长及功能的影响 生物组织和细胞的生长受多种因素的影响，如营养、生长因子、物理和化学环境以及应力和应变等。如果其他条件相同，则应力—生长规律将会显露出来。 从根本上说，细胞和组织的生长是一种分子水平下的细胞生物学现象。应力和应变使细胞保持某种特殊的形态，由于细胞生长决定于这种形态以及其他因素，因此它也决定于应力和应变。

细胞与材料的应力场三维培养 体内细胞多在特定的生物力学环境下分裂、增殖，发挥生理功能： 不仅需要研究材料进行改性处理，有利于细胞在材料三维空间附着及分裂增殖的机制及方法 还需研究在体外提供相适应的应力环境的方法，研究细胞在不同应力场环境下的形态和功能的改变，对细胞在材料上的粘附力及其影响因素的作用机制。

正常细胞的细胞外基质 细胞外基质的成分及其功能。 基质中粘附分子及其功能。 基质金属蛋白酶及其抑制因子。 细胞外基质的调节与细胞因子。

细胞与细胞外基质相互作用及对组织工程的影响 细胞－细胞外基质相互作用；粘附和移行、增生、分化和凋亡。 细胞外基质在细胞生长和分化中的机械化学转化。细胞外基质的构成和组建、细胞的粘附性、规则组织更新的支架、细胞生长、分化和凋亡的调节。 细胞外基质的重塑与组织构型。 细胞外基质对组织工程的意义。

研究组织替代物，必须考虑以下几个因素 需要避免引起炎症和／或排斥反应的免疫应答。 需要为细胞生存和分化创造一个合适的基质。 需要创造一个合适的环境以维持组织细胞的特殊功能。

组织工程的细胞基质 组织工程研究最基本的思路是在体外分离、培养细胞，将一定量的细胞接种到具有一定空间结构的支架上，通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖和分泌RCM，从而形成具有一定结构和功能的组织或器官。其中RCM替代物的研究是组织工程研究的焦点之一。

理想的组织工程基质材料应具备下列条件 良好的组织相容性。 良好的表面活性。 具有可塑性。 生物可降解性。 具有三维立体结构。

B 支架材料及细胞外基质的研究 不同组织由于功能不同，其支架材料及ECM亦不同，需研究用于不同组织缺损修复及构建人工器官的支架材料的设计，组装，物理化学性质； 材料表面性质，材料的细胞相容性、组织相容性及体内过程； 材料力学及材料体内生物力学； 研究材料可控降解的技术与方法，材料降解与细胞功能同步化的方法及机制等。多种ECM如胶原、粘多糖、硫酸软骨素等，在细胞分裂、增殖、维持体内微环境中的作用、影响因素及其机制，ECM与支架材料的相互作用机制。

C 体内植入研究 将三维培养的组织工程化产品做动物体内植入，主要研究组织相容性； 材料降解与细胞功能的发挥同步化； 代谢活动，营养来源，血管化过程及方式；与机体的愈合方式； 与生长发育的关系，细胞的作用及转归，植入体的最终结局； 体内生物力学，免疫学； 对药物治疗的反应等。

D 检测方法及检验标准 组织工程的研究结果，最终要用于人体。在进入临床应用前，需建立检测方法及评价标准。因为这是一项崭新的技术，目前尚没有可借鉴的检测方法及检验标准，应在组织工程研究的同时，研究制定各种组织工程产品体内植入的标准及检测方法。

E 临床验证研究 研究结果试用于临床后，将临床结果反馈，进一步改进基础研究，再回到临床验证，经过几次反复，使研究结果成熟，用于临床，服务于病人。

F 产业化研究 组织工程产品属于生物制品，需研究标准化批量生产的工艺、包装、贮存、运输、人体植入前处理、植入后监测等产业化过程，同时研究审批程序、机构，以及制定相应的政策法规。 在这些科学问题解决之后，组织工程产品将会被推向市场。对市场前景的预测又将是政府及企业界投入组织工程研究的动力。因此在某种意义上，对未来市场的预测将会推动组织工程学的开发与研究。

组织工程学研究与经济发展的关系 据Vacanti及Ianger的一项调查表明，美国每年花在有器官及组织损害病人身上的资金高达4 000多亿美元，几乎占全美国医疗费用的一半。 美国的医院每年要为这些病人作800万例次手术，然而并不能挽救每一个人的生命或避免残废。 每年约有4 000人在等待器官移植时死亡，还有约10万人在未被列入等待器官移植时就已死亡。 用于骨缺损修复的骨移植手术在美国务医院是仅次于输血的组织移植手术。

组织工程学前景广泛 约有1 000万人因尿道功能失调，尿失禁或尿液返流，等待组织工程产品植入治疗； 约有100万个膝关节半月软骨等待替代； 每年有1000万例牙科手术，其中需新放入9 000万个充填物，另有2亿个过去放入的充填物需要更换。 每年约有200万例以上的皮肤慢性溃疡，其中50万例系糖尿病性肢体缺项血，需要组织工程化皮肤移植治疗。

病患需要组织工程材料协助治疗者 皮肤烧伤2,150,000人/年。 骨关节置换558,200人/年。 骨移植275,000人/年。 骨科内固定480,000人/年。 血管移植1,360,000人/年。 肾移植600,000人/年。 输血18,000,000人/年。 牙科材料10,000,000人/年。

组织工程化植入物的移植免疫 自体细胞。 同种异体细胞。 细胞系。 异种细胞。

自体细胞 自体细胞可避免受者免疫系统的排斥反应，这是自体细胞较其他来源的细胞最大的优点。 自体细胞可以通过在体外培养特定的细胞，经一段时间扩增到足以满足植入物功能需要的数量，以达到病人的需要。 自体来源细胞的主要限制是从病人获取组织，是否有可能获得足够细胞培养的组织量，培养扩增细胞和构建植入物需要一定时间。

同种异体细胞 同种异体细胞也可以在体外培养到足够数量；若预先培养并保存足够数量的细胞，那么，即使是立即需要也是可能得到的。 同种异体来源的细胞同样存在着培养中细胞的变异和体外扩增受到限制等制约因素，细胞系可解决这些问题。

细胞系 细胞系具有无限生长的能力，可用来克服目前细胞培养技术在培养中扩增特定细胞种类时受到的限制。 细胞系通常经基因技术(分子生物学技术)，使细胞发生遗传学改变，并适于无限生长，这些改变还常伴有分化功能的丧失。细胞系还可通过基因工程技术使细胞产生所需的治疗性蛋白、行使分化细胞功能、或克眼宿主免疫反应。 但是，当使用细胞系时，必须考虑其安全性，细胞系表现出部分肿瘤样改变的性质。

异种细胞 对于一些不能通过同种异体或自体来源满足的细胞、组织可采用异种细胞、组织。 细胞包裹、免疫保护、体外系统和基因改造技术等方法使异种细胞的应用成为可能，一旦成功则只要通过繁殖动物就可满足需要。

异种细胞移植存在的问题 非自体细胞移植过程中必然发生不同程度的排斥反应，与器官移植不同，它不具有正常器官的解剖结构，一般不需吻合血管；在提纯、培养的过程中，常发生损伤和活力丧失或减弱，经过几代传代繁殖后，有可能发生变异；由于失去正常生存环境，长期生长常不利。

异种细胞移植存在的问题 非自体细胞用于组织工程实践时，病人的免疫系统摧毁植入物是最大的难题。尽管同种异休移植免疫排斥反应与异种移植免疫排斥反应机理明显不同，但仍有一些共同特点，补体介导的排斥反应被认为是异种移植的主要障碍(超急性排斥)。一旦超急性排斥得以防止，异种移植将面临与同种异体移植物排斥相同的许多问题。

谢谢