第7章 基因工程菌的培养 我们都知道利用基因工程技术，能够打破种、属的界限，将不同菌株的优良性状集中到一株菌上，选育出高产、优质、易自动化生产和现代化管理的超级生产菌—工程菌。因此，通过大规模培养基因工程菌就能生产出许多原来无法获得的天然生物制品，特别是基因工程药物。下面我们仅从生产角度，探讨工程菌大规模培养中的两个关键问题。

7.1 工程菌的稳定性 一、工程菌不稳定的表现 虽然工程菌具有许多优点，能生产出许多原来无法生 产的制品，但大量研究发现，工程菌在保存和发酵过程中常常表现出不稳定性，因而工程菌稳定性的解决是基因工程菌大规模培养的关键问题。这是由于工程菌的不稳定将使我们无法得到预期的目的基因的表达产物或影响产量。

工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。具体表现为：质粒的丢失、重组质粒发生DNA片段脱落和表达产物的不稳定。 由于工程菌的不稳定，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物的发酵过程。在非选择性条件下，含重组质粒的工程菌的比生长速率(+)往往小于不含重组质粒的宿主细胞的比生长速率( -)。因此，宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵是非常不利的。

二、引起工程菌不稳定的一些因素及对策 工程菌稳定与否，取决于质粒本身的分子组成、宿主细胞的生理和遗传特性及环境条件等三个方面。前两个方面在基因工程课中已有介绍，在此就不再累述，下面仅就大规模培养中环境条件对工程菌的稳定性作一介绍。

培养基的组成 工程菌不稳定的因素 培养温度 菌体的比生长速率 控制基因的过量表达

1、培养基的组成 培养基组成可能以不同途径和机理影响重组质粒的代谢途径和特征，从而影响工程菌的稳定性。因此，为了控制质粒丢失，在摸索培养条件时首先要进行培养基的筛选。一般，质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达。 返回

2、培养温度 重组质粒导入宿主细胞后，宿主细胞的生理生化特性会因重组质粒的存在而发生改变，宿主细胞本身的最适生长温度也会改变，因此，进行工程菌培养时必须探索其最佳培养温度。通常低温有利于重组质粒的稳定遗传。 返回

3、菌体的比生长速率 菌体比生长速率对工程菌的影响，实际上是培养基成分、培养温度、pH、搅拌和供氧等综合作用的结果。 如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失，导致工业上倒罐；如果宿主菌的比生长速率比工程菌小，大量繁殖时因竟争性利用基质，宿主细胞将会受到抑制，对发酵影响不大。因此，从理论上来看，调整这两种菌的比生长速率可以提高工程菌的稳定性。但是，这点往往难于做到，因为大多数工艺参数将同时提高或降低这两种菌的比生长速率。 返回

4、控制基因的过量表达 提高质粒的稳定性的目的是为了提高工程菌的发酵产率。但是许多研究发现，外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。 如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒就不可能丢失，工程菌与宿主细胞的比生长速率就可能相同。因此，可以采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数和转录、转译效率使外源基因高效表达。

控制外源基因过量表达的方法： 如构建含可诱导启动子的工程菌，这种工程菌发酵生产时，可选择培养条件使启动子受阻遏制一定时间，在此期间质粒稳定遗传，然后通过去阻遏（诱导）使质粒高效表达； 采用温度敏感型质粒，温度较低时质粒拷贝数少，当温度升高到一定时质粒大量复制、拷贝数剧增。

7.2 高密度培养(High cell-density culture, HCDC) 为了大量获得基因工程产品，通常采用高密度培养技术，即提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。这样不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可缩短生产周期、减少设备投资，最终降低生产成本。 在排除所有发酵条件限制的情况下，Riesenberg从理论上计算了大肠杆菌所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW)/L，而实际上迄今为此，重组大肠杆菌最高密度为175.4 g(DCW)/L。 为了实现工程菌的高密度培养，除与工程菌本身的表达性质有关外，还与工程菌培养的工艺参数有关，如培养基组成、培养温度、pH、稳定的比生长速率、适宜的溶解氧以及培养物的合理流加方案。

一、重组大肠杆菌的高密度培养 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案。 大肠杆菌在葡萄糖过量或缺氧条件下会引起“葡萄糖效应”，积累大量有机酸（乙酸）而影响工程菌的生长和外源蛋白的有效表达。因此，重组大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源降低“葡萄糖效应”是成功的关键。常见的流加技术有：恒速流加、变速流加、指数流加和反馈流加。

1、恒速流加 限制性基质以恒定流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。通常以补料前的耗糖速率作为流加补料速率。 特点： 相对于发酵罐中的菌体来说，营养物的浓度逐渐降低; 比生长速率也慢慢降低; 菌体密度呈线性增加。

2、变速流加 限制性基质以变速或梯度增加流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。 特点： 这样可以克服恒速流加中营养物的浓度逐渐降低的缺陷，菌体在较高密度下通过流加更多营养物质来促进菌体的生长，并对产物的表达有利。 比生长速率不断改变。

3、指数流加 恒定比生长速率的一种流加限制性基质的培养技术。是一种简单而又有效的补料技术。 特点： 流加速度指数增加，菌体密度也指数增加； 它能够使发酵罐中基质的浓度控制在较低的水平，这样就可以大大减少乙酸的积累； 还可以通过控制流加速率来控制菌体的生长速率，使菌体稳定生长的同时有利于外源蛋白的充分表达。

为了降低乙酸的积累，减少其对工程菌的抑制作用，通常比生长速率控制在较低水平，一般为0.1~0.3 h-1。 流加速率按下式进行计算： 式中，MS – 基质的质量流加速率，g/h; F –体积流加速率，L/h; SF—流加液中基质的浓度，g/L;  – 比生长速率，1/h; YX/S—菌体得率，g/g; m—比维持系数，g/g(DCW).h; X—细胞密度，g(DCW)/L; V—发酵液体积，L； X0—开始补料时细胞密度，g(DCW)/L; t—从开始补料起的发酵时间，h 为了降低乙酸的积累，减少其对工程菌的抑制作用，通常比生长速率控制在较低水平，一般为0.1~0.3 h-1。

4、反馈流加 以发酵参数,如pH、DO、OUR、CER和菌体浓度，作为控制对象，控制流加速度，使发酵液中葡萄糖浓度维持在较低水平的一种流加培养技术。常见的有恒pH法和恒溶氧法。 A 恒pH法 大肠杆菌代谢葡萄糖产生乙酸将导致pH的降低，因此pH降低速率与葡萄糖消耗速率成正比。当pH降低过快时，说明葡萄糖过量，来不及完全氧化，产生了过量乙酸，即流加速度过快，此时应将其流加速度减慢；否则相反。

B 恒溶氧法 发酵过程当葡萄糖耗尽时，发酵液的溶氧将迅速升高。因此，发酵过程中溶氧水平和糖流加速率与工程菌的酵解过程和代谢物的完全氧化有很大关系。具体表现为： 缺氧即溶氧值低将迫使糖代谢进入酵解途径，产生乙酸，对工程菌培养不利； 当补糖速率过快时，将导致部分糖无法及时氧化而进入酵解途径。因此，可通过控制流加速度来控制溶氧水平，降低乙酸的积累。

具体控制策略： 当溶氧过低时，说明葡萄糖过量，此时应降低流加速率； 当溶氧过高时，说明葡萄糖即将耗尽，此时应加大流加速率。

二、重组酵母菌的高密度培养 酵母是外源基因另一个常用的表达系统。其与大肠杆菌表达系统相比具有一些明显的优势，主要体现在： 酵母可达到更高密度培养，100 g /L(干细胞), 400 g/L(湿细胞)，500 OD600 酵母一般很少分泌杂蛋白，这样便有利于外源蛋白的提取和纯化； 重组产物的表达水平高，毕赤酵母的表达水平比酿酒酵母高10~100倍； 酵母作为一种模式真核生物，象许多真核生物一样，它分泌的蛋白质一般都要经过一次或多次对其功能或稳定性至关重要的翻译后修饰—糖基化，糖基化能保证蛋白质进行适当的折叠，从而保护蛋白质免受蛋白酶的降解作用，这在重组蛋白药物中是十分重要的； 同样糖基化使外源蛋白在宿主细胞中出现错误折叠的可能性比细菌要小得多，不像大肠杆菌一样外源蛋白常存在于包涵体中，则便能简化外源蛋白的分离和纯化工序。

常见的酵母表达系统有酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和毕赤酵母Pichia pastoris，后者是近年来发展起来的一种新型表达系统。下面主要介绍重组毕赤酵母的高密度培养 1、 原理 毕赤酵母Pichia pastoris为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶(AOX)。生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。因此，可利用醇氧化酶基因(AOX1)作为强启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白。

2、 影响外源基因在毕赤酵母中高效表达因素 1) 表达菌株 最常用的宿主菌为GS115(his4)，为his营养缺陷菌。 AOX基因缺失菌株比野生型菌株更容易表达外源蛋白。因此表达菌又有以下几种： KM71(AOX1 ARG4)； MC100-3：缺失AOX1、AOX2

2) 表达载体 对于非分泌蛋白采用胞内表达载体(如pPIC3, pPIC3k, pHIL-D, pAO815)，对分泌蛋白则选择分泌型载体(如pPIC9, pPIC9K, PHIL-D, pYAM7SP6等) 3) 选择强启动子 最常用的启动子为AOX1启动子：具有强的甲醇诱导能力。 也有用AOX2或DAS启动子：但甲醇诱导的强度大大低于AOX1启动子。 最近已有采用三磷酸甘油脱氢酶基因GAP启动子：不需甲醇诱导、发酵工艺简单、而且产量更高。

4) 信号肽的选择 影响外源蛋白质分泌的关键因素是外源蛋白基因本身，但是利用信号肽能更好地分泌蛋白。其中最常用的是来自酿酒酵母的-因子信号肽。也有利用外源蛋白本身信号肽的。 5) 增加外源基因整合拷贝数 毕赤酵母载体在宿主染色体上大多数为单拷贝整合，而且即使单拷贝也能获得较高产量，但是也有一些例子表明提高拷贝数可大大增加表达水平。

6) 转化方法的选择 通过不同的转化方法提高拷贝数。毕赤酵母的转化方法主要有电激法、原生质体法和氯化锂法。其中原生质体转化法使细胞群中产生多拷贝转化子的频率相对较高。

3、 高密度培养技术 重组毕赤酵母Pichia pastoris的同样可以采用重组大肠杆菌的高密度培养技术。具体方法主要是下面的所谓“三段法”(Three-stage process): 第一阶段，在甘油或葡萄糖为碳源的合成培养基中进行工程菌的分批培养，以积累菌体细胞；第二阶段，在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培养，以进一步提高菌体量；第三阶段，即诱导阶段，开始较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。

近年来，又出现了所谓混合补料工艺，即在诱导阶段，以一定比例和速度流加甲醇和甘油混合料液。该工艺的主要优点是：1) 提高细胞存活力；2) 缩短诱导时间；3) 提高重组蛋白的生产速率。但是过量甘油的流加，又将抑制甲醇利用途径，导致外源蛋白的表达水平降低。 重组毕赤酵母Pichia pastoris的大规模培养的高密度培养时要注意控制代谢副产物乙醇的量，同时还要注意控制甲醇的流加量，它们都将抑制细胞的生长，后者还将影响表达水平。

发酵液中甲醇浓度高于5 g/L时，会严重抑制细胞的生长。 控制甲醇的流加量措施： 恒溶氧(DO)法：当甲醇流加速率过快时，DO上升；反之甲醇流加速率过慢时，DO降低。 利用甲醇传感器，控制发酵液中甲醇的浓度。 醇传感器：FRINGS ALKOSENS alcohol sensor (Heinrich Frings, Bonn, Germany)

思 考 题 影响工程均不稳定的因素有哪些？ 2. 何谓高密度培养？重组大肠杆菌的高密度培养的关键和核心是什么？其培养技术有哪几种？ 2.    何谓高密度培养？重组大肠杆菌的高密度培养的关键和核心是什么？其培养技术有哪几种？ 3.    请简述毕赤酵母作为外源蛋白表达系统的原理。何谓“三段法”？重组毕赤酵母高密度培养时应注意哪些问题？