1.2基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序主要包括 四个基本步骤： 1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测与鉴定

基因工程的基本步骤

目的基因的获得

(一)、目的基因的获取 目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因 获取目的基因的方法： 获取目的基因是实施基因工程的第一步。 目的基因来源 可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。 目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因 获取目的基因的方法： ①从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库） ②利用PCR技术扩增目的基因（变性，复性，延伸） ③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成

①从基因文库中获取目的基因： 基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.

基因文库的构建模式图 通过对 受体菌 的培养而 储存基因

基因组文库与部分基因文库的关系 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （cDNA文库）

cDNA

用分子杂交的方法从基因文库中钓取目的基因

是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 PCR:聚合酶链式反应： 原理： DNA双链复制 条件： 模板DNA（已知基因的核苷酸序列）、引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸 过程： 变性、复性、延伸 结果： DNA以指数方式扩增，即2n （n为扩增循环的次数）

变性 复性(或退火) 延伸 引物 引物

基因表达载体的构建 思考： 1、构建基因表达载体的目的是什么？ 2、如何构建基因表达载体？ 3、基因表达载体至少带有哪些结构？各有什么作用？

(二)、基因表达载体的构建 目的：使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 目的：使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

构建基因表达载体的步骤 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。

基因表达载体的组成： 启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端， 终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA 目的基因、启动子、终止子、标记基因 启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端， 是RNA聚合酶识别和结合的部位。 终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA 片段，使转录在所需要的地方停止下来。 标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因， 从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

目的基因导入受体细胞 1、导入植物细胞常用的方法是什么？具 体过程是怎样的？ 2、导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？ 1、导入植物细胞常用的方法是什么？具 体过程是怎样的？ 2、导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？ 3、导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？

转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (三)、将目的基因导入受体细胞 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

（1）目的基因导入植物细胞 常用：---农杆菌转化法(感染双子叶植 物和裸子植物) 基因枪法（单子叶植物） 花粉管通道法

饱子植物 种子植物 裸子植物 被子植物 单子叶植物 双子叶植物

农杆菌转化法 目的基因的获取 目的基因与农杆菌Ti质粒结合 导入受体细胞 导入植物细胞 目的基因整合到植物细胞染色体上，随染色体复制，并表达一定性状 农杆菌侵染

（2）将目的基因导入动物细胞 显微注射技术： （先提纯基因表达载体，再体外注射入受精卵中，最后将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体。

（3）将目的基因导入微生物细胞 常用大肠杆菌： 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少 大肠杆菌的转化方法： 首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。

目的基因的检测与鉴定 导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？ 什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？ 利用抗体－抗原杂交检测的原理是什么？

（四）目的基因的检测和表达 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传性状，只有通过检测与鉴定才能知道。这是检查基因工程是否成功的一步。

首先，要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。 其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。 检测方法是采用分子杂交技术 最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质。 检测方法是进行抗原---抗体杂交

基因探针： 基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。

DNA分子杂交原理： 其基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。

（四）目的基因的检测和表达 1、分子水平的检测：分子杂交技术 2、个体生物学水平的签定（根据性状）

练习 C 1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来

练习 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D

练习 A 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶

练习 D 4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

练习 C 5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C

（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。