血 红 蛋 白 的 提 取和分离 分离生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 蛋白质分离和提取的原理 概念 凝 胶 色 谱 法 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。 原理 蛋白质分离方法 ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。 概念 电泳 原理

概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 原理 ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 电泳

二、实验操作 （一）蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 （二）操作过程 1.样品处理： 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤: ①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。 ②洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。

(2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

2．血红蛋白分离实验操作

(4)透 析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

思考下面的问题： 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？ 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

[做一题] [例3]　红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。根据材料回答下列问题： (1)实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠， 取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_________________________。

(2)在对样品进行处理时，主要包括________、血红蛋白的 释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析技术的原理是_____________________________。 (3)同学甲利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分 离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速率的因素包括蛋白质分子的________、________以及分子的形状等。 (4)同学乙利用凝胶色谱法进行血红蛋白的分离(如图一)， 他在操作中加样的正确顺序是________，在执行图一中②所示操作时，色谱柱下端连接的尼龙管应该________(打开或关闭)。

[解析]　 (1)加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。(2)对样品的处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析的原理是小分子可以自由进出透析袋(半透膜)，而大分子不能通过。(3)电泳时，影响蛋白质迁移速率的因素有蛋白质分子大小、带电性质及分子的形状等。(4)正确的加样顺序可依据样品在色谱柱及凝胶层中的渗入量进行分析，可以得出是④①②③；同时进行②所示环绕加样时，应打开下出口。(5)SDS凝胶电

泳装置是垂直的装置，此种电泳方法主要取决于蛋白质分子量的大小，与电荷无关，同时加样在“－”极，通电后，样品蛋白质向“＋”极移动，分子量相对小的，移动距离大，因此从图二的电泳结果分析，P比N、M移向“＋”距离大，说明P的分子量相对比较小，因此洗脱出来的时间比较长，符合图三中的丙。

[答案]　 (1)防止血液凝固　(2)红细胞的洗涤　小分子可以自由进出透析袋(半透膜)，而大分子不能通过　(3)大小　带电性质　(4)④①②③　打开　(5)丙

植物的组织培养技术 基础知识 （一）植物组织培养的基本过程

培养基配制方法、无菌技术及接种操作基本相同 高频考点突破 考点一： 植物组织培养技术 1．菊花组织培养与月季花培养的比较 菊花组织培养 月季花药培养 相 同 点 原理 细胞的全能性 环节 培养基配制方法、无菌技术及接种操作基本相同 条件 受激素、pH、温度、光照等条件影响

制备培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培 选材→消毒→接种→培养→鉴定和筛选→移栽 不 同 点 选材 未开花植株的茎上部新萌生的侧枝 合适的花粉 发育时期 培养基 MS培养基 配方要求更严格 流程 制备培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培 选材→消毒→接种→培养→鉴定和筛选→移栽

2.植物激素在组织培养过程中的重要作用 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点为：

激素使用 实验结果 使用 顺序 先生长素后 细胞分裂素 有利于细胞分裂 先细胞分裂素后 生长素 细胞既分裂也分化 生长素与细胞 分裂素同时使用 分化频率提高 生长素用 量与细胞 分裂素用 量的比例 该比值高时 利于根的分化， 抑制芽的形成 该比值低时 利于芽的分化， 抑制根的形成 该比值适中时 促进愈伤组织的生长

满足离体植物细胞在正常代谢途径受一定影响后所产生的特殊营养需求 3.MS培养基的成分及各成分作用 成分 作用 微量和大量元素 提供植物细胞生活所必需的无机盐 蔗糖 提供碳源，维持细胞渗透压 甘氨酸、维生素、烟酸、肌醇 满足离体植物细胞在正常代谢途径受一定影响后所产生的特殊营养需求

【特别提醒】 MS培养基与微生物培养基的区别： 微生物培养基包括水、无机盐、碳源、氮源和生长因子，以有机营养为主。MS培养基则需提供大量的无机营养，尤其是植物生长所必需的大量元素和微量元素。

（二）影响植物组织培养的因素 不同的植物组织 同一植物的不同材料 营养、环境条件 植物激素

1、果胶 植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水。

果胶酶 果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶脂酶等。 在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解果胶，瓦解植物细胞的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。 果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶脂酶等。

２、探究果胶酶的用量 　 探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和pH对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是 ，其他因素都应 。 果胶酶的用量 保持不变 方案：可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的pH必须相同，否则将影响实验结果的准确性。