动物细胞培养 生物技术 00274024 陈克念

一、 细胞培养的现实意义 生活上：生产药物、食品等。 科研上：如癌细胞的研究等。 经济上：将实验成果转化为生产力，生产生物技术商品。

二、细胞培养基本概念 　　细胞培养是指在人工提供的条件下细胞在生物体外进行的生长。 它包括动植物，微生物细胞的培养。

二、细胞培养的环境 　　细胞在体外培养中所需的条 件与体内细胞基本相同。

细胞培养的环境 1、无污染环境 2、恒定的温度 3、气体环境 4、细胞培养基

1、无污染环境 　　培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。 因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

2、恒定的温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。例如人体细胞培养的标准温度为36. 5℃±0 2、恒定的温度 　　维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。例如人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力较对高温强。

3、气体环境 　　气体是培养细胞生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它的主要作用在于维持培养基的PH值。

4、细胞培养基 　　培养基是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的物质基础，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。 培养基种类很多，按物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。 　　

天然培养基：直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液。特点是营养价值高，成分复杂，来源有限。如血清、鸡胚汁等。 合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。 （p141）

5. 培养细胞的分类 按培养的动物细胞生长方式，培养细胞可以分为贴壁依赖性细胞（贴壁培养）和非贴壁依赖性细胞（悬浮培养）两种类型。 前者在培养时必须贴壁附于培养器皿表明上才能正常分裂增殖，且只能单层生长。（多数动物细胞） 而后者多为肿瘤细胞（可悬浮培养）。

下面介绍具体实验

人体遭受烧伤后，皮肤形成极大的创面给病原感染带来机会。因此必须尽早有效的封闭烧伤创面。 皮肤细胞培养 人体遭受烧伤后，皮肤形成极大的创面给病原感染带来机会。因此必须尽早有效的封闭烧伤创面。

而大面积、特大面积烧伤的患者自体皮肤不足，采用异源皮肤又有免疫排斥的问题，所以，在体外进行快速的自体皮肤细胞培养，对于治疗烧伤有重大意义。

从理论上讲 ,表皮细胞培养技术只需 4～ 8ｃｍ2 的皮肤标本 ,分离表皮角质形成细胞后培养 3～ 4周 ,即可扩增 1 0 0 0 0倍 ,生成的膜片可覆盖全身并成为永久性生物覆盖物。

但是移植后的膜片由于缺乏真皮组织 ,特别是缺少表皮和真皮间的基底膜 ,移植后易于与创面分离起泡。外观和功能均不理想。

可用异种 (体 )真皮或真皮替代物 (如胶原膜、纤维蛋白胶等 )作为基底物质 ,先在其中接种成纤维细胞形成真皮类似物 ,而后于其表面接种自体表皮细胞 ,并让其处于培养皿中气－液体交界面处生长 ,表皮细胞暴露于空气之中 ,在近似生理的条件下得到充分的分化 ,最终形成具有表皮层和类似真皮结构的皮肤类似物。

基本培养方案 1 配制培养液； 2 分离细胞（取材）； 3 接种； 4 原代培养； 5 传代培养； 6 检测；

1——培养基的配制 DMEM＋H2O＋青霉素＋链霉素 （p139－150）

2——分离表皮细胞(一般做法) 手术切取皮片在生理盐水中冲洗 ,用眼科剪刀在皮片上打洞 ,间距为 0.5～ 1.0ｃｍ。浸于 ｄｉｓｐａｓｅ酶中 ,4℃冰箱消化1 8～ 2 4小时。用Ｈａｎｋs液冲洗一遍 ,用ＤMＥＭ培养液漂洗一遍。将表皮分离并置于胰蛋白酶和 ＥＤＴＡ混合液中 ,吹打成细胞悬液 ,将细胞悬液加入含胎牛血清的培养基中 ,离心将分离的皮肤细胞以培养基调整细胞浓度进行培养。台盼蓝染色计数活细胞。

3——接种 在已经培养了真皮替代物或异种真皮作为基底物质的培养基上接种表皮细胞。加入培养液，置于CO2 培养箱内培养。 （美国德克萨斯ＬｉｆｅＣｅｌｌ公司生产等公司生产真皮替代物）

4——原代培养(p151) 原代培养是指将肌体取出的细胞进行初次培养的过程。初次培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞成为原代细胞。 注意观察，细胞的活力，形态，数目 贴壁等情况（p154）。及时更换培养液，保持细胞处于液气交界处。当细胞培养成薄片，可传代培养。

5——传代培养 从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。 原代培养成功后细胞扩展成片，为增加产量，应转接传代培养。 传代培养主要是要注意把握转接的时间，过早细胞产量不足，过晚，细胞活力不佳。

6——检测 倒置显微镜观察。 移植方面就不多说。

问题： Q1：为什么产用真皮替代物或异种真皮作为基底物质？会不会造成免疫排斥？ Ans：a.真皮替代物可为表皮细胞提供附着和增殖的支架 ,提高表皮细胞膜片的移植成功率 ,并改善愈合质量。b.真皮成分能影响表皮细胞的迁移、分化、粘附和生长。 含有成纤维细胞的真皮替代物不但不会引起免疫排斥反应 ,而且可促进表皮细胞生长 ,促进真皮表皮连接形成 ,改善移植物的物理性能和美观效果 ,使其柔软接近正常皮肤。

Q2：为什么用气液界面培养法？ Ans：传统的表皮细胞培养法是使细胞于培养液液面以下生长 ,这在一定程度上阻碍了表皮细胞桥粒层的自然分化和基底膜形。 气液界面培养模拟表皮细胞生长的自然环境。该法培养的表皮细胞角化程度增大 ,具有半桥粒和基底膜结构。

Q3：培养的时间长短，皮源。 Ans：由于培养足够的自体表皮细胞膜片需要较长的时间 ,而异体表皮细胞膜片移植又起不到永久覆盖创面的作用 ,最终仍将被机体排斥。 有人用自体异体细胞混合培养，获得成功。解决皮源不足问题。

展望 培养的表皮细胞自体或异体移植以及与真皮替代物结合组成人工复合皮肤以实现创面修复的研究 ,是当前国内外医学领域的前沿课题 ,已取得可喜进步并初步应用于临床。尽管目前尚存在一些问题 ,但随着组织工程技术的进步以及同其他学科的合作 ,在不远的将来 ,有可能取得重要突破。未来的复合人工皮肤很可能就是培养的自体或异体表皮细胞与真皮替代物的结合。用剔除次要 ,和主要组织相容性抗原基因的非免疫性同种异体表皮细胞和成纤维细胞在体外重组皮肤 ,将从根本上解决自体表皮细胞移植存在的培养时间过长问题。通过基因转染手段 ,将促进创面愈合的各种细胞因子基因导入培养的表皮细胞或成纤维细胞中 ,移植于创面 ,有可能加快创面愈合的速度。