南海红树林内生真菌SBE-14培养条件的优化研究 指导教师 : 佘志刚 副教授 答 辩 人 : 包云玉 专 业 : 应用化学(化学生物学)

主要内容 海洋微生物代谢产物研究现状 选题意义 研究方案 实验及讨论 实验结论 致谢

一、海洋微生物代谢产物研究现状 陆生资源的日益匮乏 耐药性的出现 海洋资源丰富 海洋微生物 新增疾病速度加快 社会发展的要求

一、海洋微生物代谢产物研究现状 在过去10多年中已从海洋生物中分离到数百种有机化合物, 其中近百种属世界上首次发现。有的化合物结构奇特, 在陆地生物中从未发现过。不少具有降血压、抗心律失常、抗癌、消炎等活性。 相对于天然产物研究的丰富成果，海洋真菌的研究工作起步较晚，但进展很快。20世纪80年代末，海洋真菌的研究工作开始初步发展，至今已成为海洋微生物研究的热点之一。

一、海洋微生物代谢产物研究现状 《Marine Natural Products》中海洋真菌的研究统计（图1）

一、海洋微生物代谢产物研究现状 从海洋微生物中寻找新药具有很大的优势。寻找红树林真菌生理活性天然产物的化学研究只在几年前才开始，而红树林内生真菌代谢物的研究则是刚刚开始起步。因此，其前景非常广阔。

二、选题意义 本论文研究的红树林内源真菌（编号NO. SBE-14），采自香港，菌种分别保存在香港城市大学和中山大学内。经由中山大学郭志勇博士的研究，在真菌SBE-14的甲醇混合溶液提取物及培养液提取物中已分离到16个化合物，其中3个新化合物。 本人所在的课题小组，在对南海红树林内生真菌SBE-14的活性代谢产物的进一步研究中，又陆续分离得到了几种具有抗肿瘤活性的化合物，如：对神经质瘤有抑制效果的Austdiol；体外抑制两种不同口腔癌细胞KB，KBv的IC50 都小于1μg/mL的Secalonic acid A等。

二、选题意义 化合物Austdiol和Secalonic acid A的结构式（图2）

二、选题意义 从海洋红树林内生真菌SBE-14中分离发现的有良好药理活性的代谢产物，对于开发新型药物具有积极的意义。但是，如何才能大量获取目标代谢产物，以达到大规模制药的需求，则需要我们对真菌SBE-14进行培养条件的优化设计，寻找最利于产生目标代谢产物的最优化培养条件，以达到大量生产目标代谢产物的目的，为其进一步深入的药理研究，甚至最终的成药，提供来源基础。

三、研究方案 LC-MC检测 收菌（培养 30天） 菌体干重 提取培养液 HPLC法检测Austdiol浓度 SAS软件分析 复筛培养基 （ Plackett-Burman设计 ） 收菌（每周 一次） 初筛培养基 菌体干重 提取培养液 绘制生长曲线 HPLC法检测Austdiol浓度 确定最适碳、氮源

真菌SBE-14在三种培养基中的形态 培养基 培养时间/天 7 14 21 30 A (葡萄糖) h（土豆浸液） 复筛培养基 培养30天

四、实验及讨论 4.1 初筛确定最适碳、氮源 真菌SBE-14 对碳源的需求， 如图3和表1：

4.1 初筛确定最适碳、氮源 真菌SBE-14对氮源的需求，如图4和表2：

4.1 初筛确定最适碳、氮源 tR = 6.065min 初筛培养液提取物与标样ＨＰＬＣ谱图对照（图5）： 色谱条件为： 30%（HCN/H2O）：40%（MO/H2O）= 1:1流动相； 流速0.8mL/min， 检测波长254nm， 灵敏度0.100AUFS， 进样体积5μl。

m/z＝236 图6 化合物 Austdiol EI-MS

m/z＝237.1 m/z＝5.63 图7

四、实验及讨论 4.1 初筛确定最适碳、氮源 　　　综合菌体干重和目标代谢产物Austdiol的产量，确定葡萄糖为本实验中真菌SBE-14培养的最适C源。本人所在的课题小组，在之前对南海红树林内生真菌SBE-14的培养中，已发现它在土豆培养基(PDA)中生长情况很好。结合本实验的分析结果，亦可得到同样的结论。故将土豆浸液作为真菌SBE-14培养的最适N源。

四、实验及讨论 4.２ Plackett-Burman 法初步优化培养基组成 　　　本试验选定８个因素为自变量，以真菌SBE－14菌体干重（Y1）和培养液中Austdiol浓度(Y2)为响应值，根据 Plackett-Burman设计原理，选定N =12 对8个因素及一个误差项（X9）进行研究，各因素均取两个水平：高水平“ 1 ”和低水平“ -1 ”。

序号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y1 Y2 1 -1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

代码 参数 低水平（-1） 高水平（1） X1 土豆浸液（g/L） 200 300 X2 葡萄糖（g/L） 10 15 X3 海盐（g/L） 2.5 4.0 X4 PH 7.0 8.0 X5 磷酸氢二钾（g/L） 0.2 0.3 X6 硫酸镁（g/L） 0.5 0.8 X7 硫酸亚铁（g/L） 0.1 X8 氯化钾（g/L） X9 误差项 —

配制目标代谢产物Austdiol的系列稀释浓度：2. 5μg/mL、5 配制目标代谢产物Austdiol的系列稀释浓度：2.5μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，进行高效液相色谱分析。分析结果如下（图8）： 根据目标代谢产物Austdiol 的高效液相色谱分析数据，以峰面积为纵坐标，标准对照品系列浓度为横坐标，做标准曲线（图9）。

其线性回归方程为： Y=0.979058*X -1.63989 r=0.999955 (n=6) 可知在所用的测试条件下：浓度在2.5 ~100 ug/mL 范围内，峰面积和测定浓度呈极好的线性关系

首先对12组复筛培养基培养液提取物，进行HPLC 分析，并通过各组在tR=6 首先对12组复筛培养基培养液提取物，进行HPLC 分析，并通过各组在tR=6.06处的保留峰峰面积计算其浓度，最终得到了培养液中代谢产物Austdiol 的含量 图10

再对复筛培养基培养液提取物，进行LC-MS检测，在tR = 5. 64 时的ESI-MS (+c) 显示出 m/z=237 　 再对复筛培养基培养液提取物，进行LC-MS检测，在tR = 5.64 时的ESI-MS (+c) 显示出 m/z=237.1 的基峰，与标准物 Austdiol 的分子离子峰相同，再次证明了培养液中有Austdiol 产生。 m/z=237.1 tR = 5.64 图11

Plackett-Burman试验设计和结果见表4：

各因素主效应分析结果（表5） ：

运用Plackett - Burman法，对表中的数据通过逐步回归分析，获得最优多元一次回归方程为： Y1 = 1.069362 + 0.2912610*X2 + 0.2700670*X5 Y2 = 0.761239 + 0.404630*X2 - 0.121882*X3 + 0.254203*X5 + 0.306676*X6 + 0.325856*X7

四、实验及讨论 4.２ Plackett-Burman 法初步优化培养基组成 　 显著性检验结果显示菌体干重的主要影响因子为：葡萄糖（P＝0.004906）和K2 HPO4·3H2O（P＝0.005699）。 同理，影响Austdiol代谢量的主要因素有：葡萄糖，海盐，K2 HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O 。

利用SAS软件对菌体干重和Austdiol的代谢量数据进行方差分析，方差分析结果见表6：

四、实验及讨论 4.２ Plackett-Burman 法初步优化培养基组成 　　　方差分析表明，所得菌体干重回归方程达到极显著（P＝0.0001），说明该回归模型在整个回归区域有很好的拟合效果，决定系数R2＝0.8659，表明86.59％的试验数据的变异性可用此回归模型来解释。 　　　Austdiol代谢量回归方程显著，且拟合程度比菌体干重的回归方程高（R2＝0.8706）。

各个因素的主要效果图（图12） ：

各因素主要效应图更直观的看到各因素斜率的大小和正负，分析结果如下： ①葡萄糖浓度对菌体的生长影响最大，其次是K2 HPO4·3H2O的浓度。葡萄糖作为碳源，在一定范围内产生正影响。K2HPO4·3H2O作为生长因子，对该菌生长在一定浓度范围内起促进作用。 ②通过高效液相检测得出，影响培养液中Austdiol代谢产量的五个重要因素：葡萄糖浓度，海盐，K2 HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，增加它们的浓度，都能促进培养液中Austdiol的代谢。

五、实验结论 通过对真菌SBE-14进行培养条件的优化设计，得到了最利于产生目标代谢产物的最适碳源、氮源，初步优化了真菌SBE-14培养基组成。 以上我们所做的培养基优化实验初步优化了真菌SBE-14培养基组成，但限于时间关系，并未得出最终的最优化培养基各组分含量。后续工作仍在进行中。 通过实验数据可知，在复筛培养第11组实验的培养液中目标代谢产物 Austdiol 的产量达到了 576.25mg/100L。初步达到了富集的效果。

致 谢 本论文是在导师佘志刚副教授的悉心指导下完成的。在此对佘老师在学习和生活上给予我的谆谆教诲和深切关怀表示由衷的感谢！ 致 谢 　　　本论文是在导师佘志刚副教授的悉心指导下完成的。在此对佘老师在学习和生活上给予我的谆谆教诲和深切关怀表示由衷的感谢！ 　　　感谢刘凡师兄给予我的指导和帮助，感谢杨虹同学给予我的协助，感谢所有天然室同学在生活和工作中对我的帮助。在这个团结融洽，不断创新的科研集体中与你们相处的时光我终生难忘。 　　　本论文的部分谱图是由中山大学测试中心的几位老师完成的，在此对他们表示衷心的感谢。 　　　本论文的研究得到化学与化学工程学院第八届(2007年度)创新化学实验与研究基金项目的资助，在此表示感谢。 　　　衷心感谢我的父母对我多年的支持，感谢所有关心支持我的亲人及朋友。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　包云玉 　　　　　　　　　　　　　　　　　　二零零八年五月于中山大学 康乐园

谢　谢　！