绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测

本实验以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）为实验材料，通过免疫印迹杂交方法分析GFP在大肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白（GFP） 是一种源于水母(Aequorea Victoria)等海洋无脊椎动物的蛋白，分子量为26.9KD，其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可发射出清晰可见的绿光荧光，且荧光性质稳定。

GFP的发光原理 GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发色基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光。 转GFP基因线虫

构成生色基团的3个氨基酸:Ser-dehy-droTyr-Gly位于第65—67位，生色基团由丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸形成的对羟苯甲基咪唑环酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)构成。

GFP能在不同的细胞内稳定表达，无种属、组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法简单，将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。 1、不需加任何底物，荧光性质稳定。（可保持10min以上） 2、无背景，即在大多数受体细胞内（细菌、植物、动物） 无相似的内源性表达产物。 3、相对分子量小，对目的基因的结构功能没有影响。 （融合蛋白质具有GFP的荧光性质和配体蛋白质的生物功能） 4、其产物表达量能定量检测，检测方法简单便捷。 （紫外检测仪，荧光显微镜，流式细胞仪等） 5、作为荧光靶，可直接用于活体测定。 （可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态）

GFP 实验流程图 基因工程技术 免疫印迹 超声粉碎细胞、提取表达蛋白 转 化 感 受 态 细 胞 提 取 含 GFP 基 因 的 质 粒 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 半 干 式 电 转 移 在膜上进行定性分析及定量检测 基因工程技术 免疫印迹

一、实验目的 1.熟悉转化表达的过程。 2.掌握免疫印迹的原理、 学习免疫印迹的操作方法。 3.了解免疫印迹的用途。

二、实验材料与用具 1、 菌种 （1） E.coli DH5α(pETH）菌株 （2）E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 （3）E.coli BL21菌株 （4）E.coli BL21 (pETH）菌株 （5）E.coli BL21 (pETH-GFP）菌株

2、试剂与材料 3、仪器及用具 紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转移系统等。

（一）质粒的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 三、实验原理与方法 （一）质粒的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 质粒 DNA：细菌细胞中小的共价闭合环状双链 DNA。（1kb～200kb） 共价闭环 DNA ，超螺旋 开环 DNA ，两条链中有一条发生一处或多处断裂 线性 DNA ，两条链在同一处断裂

碱裂解法提取质粒DNA的原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 在溶菌酶和SDS破壁释放DNA后，在强碱条件下，DNA变性成单链，当加醋酸钠(NaAc)适当中和pH时，质粒DNA复性；而Ch-DNA和大分子RNA仍为单链并与蛋白质-SDS复合物被高盐沉淀，质粒DNA留在溶液中。 再经酚 / 氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒 DNA 。

12000rpm，10min。取上清转入离心柱中，不要吸入沉淀。 §1、用试剂盒提取质粒DNA 接种单菌落于4 mL LB（含Amp） 37 ℃ ，250rpm，过夜 收集菌体于5ml 离心管内 12000rpm，15s，去上清 加入 150ul 溶液I Vortex，使菌体散开 加入 250ul 溶液II， 缓慢颠倒离心管5－8次，溶液变透明。 RT放置 3－4 min 加入 400ul 溶液III， 缓慢颠倒离心管5－8次，白色絮状物产生。静置3－10min 12000rpm，10min。取上清转入离心柱中，不要吸入沉淀。 将离心柱置于收集管内，静置1－2min 12000rpm，15s，倒弃液体。

加入 50ul 洗脱液于离心柱底层的膜上，放置1－2min 12000rpm，15s，倒弃液体 加入 400ul 漂洗液， 12000rpm，2min。 小心取出离心柱，置于1.5ml离心管上 注意不能沾漂洗液，否则应再离心。 加入 50ul 洗脱液于离心柱底层的膜上，放置1－2min 12000rpm，1min 所得液体即为提取的质粒DNA。 －20℃保存。

酶切反应 每 20ul 酶切体系所需材料 无菌ddH2O 2ul 质粒DNA 15ul 10×Buffer 2ul EcoRI 1ul 置37℃温箱酶切2hr。

酶切片断的电泳检测 制备0.8％琼脂糖凝胶板，加入适量的EB。 向酶切管里加入适量溴酚蓝，全部取出点样。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 500bp 1000bp 2000bp 3500bp 5500bp 7000bp 740bp 5400bp 1 DNA分子量Marker 2 pETH 质粒DNA 3 pETH 质粒DNA经EcoRI酶切 4 pETH－GFP质粒 5 pETH－GFP质粒经EcoRI酶切

（二）感受态细胞的制备及转化 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 对数生长期的细菌（受体细胞）经过一些理化方法(如电击法、CaCl2 法)的处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competent cells)。

CaCl2法制备感受态细胞原理 细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl 2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。 转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面。 经42℃短时间（90 秒）热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物。 将细菌在丰富培养基上生长数小时，球状细胞复原并分裂增值，在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达。 将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得转化子（带有异源 DNA 分子的细胞 ）。

CaCl2法制备感受态细胞操作要点 细胞生长状态和密度：对数生长期或对数生长前期，细胞数<108/ml 质粒的质量和浓度：超螺旋态DNA DNA体积<感受态细胞体积的5％。 1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和 试剂的质量：分析纯，用超纯水配制。 防止杂菌和杂DNA的污染 保持低温状态

§2、氯化钙法制备感受态细胞 每组转接2支试管 接种单菌落 BL21 于 4 ml LB 中 取40 ul 菌液接种于 4ml LB 加入 50μl 冷的 0.1M CaCl2，置冰上备用。 接种单菌落 BL21 于 4 ml LB 中 37 ℃ ，250rpm，过夜 取40 ul 菌液接种于 4ml LB 37 ℃ ，250rpm，（2.5hr） OD600=0.3~0.5，冰浴15min，分装每管1ml 4000rpm， 5min，去上清 加入 200μl 冷的 0.1M CaCl2，冰浴5min 3000rpm， 5min，去上清 每组转接2支试管 每半小时测一次OD600

§3、转化 加入质粒1μl，对照中加入H2O 1μl， 42℃ 90s，立刻冰浴1~2min 加入 1 ml LB 准备平板 取100 ul IPTG＋100 ul H2O混匀， 涂布 LB（Amp）平板，备用。 加入 1 ml LB 37℃，160rpm，1hr 3000rpm ，5min，去上清 加入 150μl LB，轻轻吹打均匀， 涂平板，37℃，过夜培养

接种发荧光的单菌落Bl21 (pETH-GFP)于4 mL LB（含Amp）中 §4、诱导表达 接种发荧光的单菌落Bl21 (pETH-GFP)于4 mL LB（含Amp）中 37 ℃ ，250rpm，过夜 取40 ul 接种于4 ml LB（含Amp）中 37 ℃, 250rpm, 2.5 h 加入IPTG (0.2～0.3‰) 37 ℃ ， 250rpm，4～5 h 每人接种1支试管

乳糖操纵子（Lac operon） 的结构及阻遏作用 E.coli的乳糖操纵子是可诱导的负调控型操纵子： I 基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动，使操纵子受阻遏而处于关闭状态；当诱导剂存在时可结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，关闭的基因得到表达。 调节基因 I （Lac I） 操纵序列 O （Lac operator） 启动序列 P （Lac promoter） β-半乳糖苷乙酰转移酶 β-半乳糖苷酶 β-半乳糖苷透性酶 结构基因 Z Y A 诱导剂：异丙基硫代半乳糖苷 （isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）

工程菌E.coli BL21(pETH-GFP) 的表达原理 IPTG Lac operator T7 RNA聚合酶 识别T7 promoter GFP 表达 诱导 表达合成 BL21菌 T7表达系统 pET系列载体的特点 （1）T7启动子专一性被T7 RNA聚合酶识别，而不被大肠杆菌RNA聚合酶识别。 （2）T7 RNA聚合酶具专一性及高的合成进行性。 （3）表达宿主菌：大肠杆菌BL21 含有λ溶源的T7 RNA聚合酶基因。

超声波破碎10min （冰浴，超声3sec，间歇3sec，强度0.5） 12000rpm， 4℃，20min，取上清液，-20℃保存备用 § 5、制备细胞裂解液 培养物冰浴15min 5000rpm ，6min，去上清 每管沉淀以4ml PBS重悬 5000rpm ，6min，去上清 每2管沉淀以4ml PBS重悬，（2管→1管） 5000rpm ，6min，去上清 重悬于适量的PBS（0.4ml）中 每桌（8人）的菌悬液合在一起 超声波破碎10min （冰浴，超声3sec，间歇3sec，强度0.5） 12000rpm， 4℃，20min，取上清液，-20℃保存备用 8人／桌，32 ml培养物 1～2 ml菌悬液

（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 是目前对蛋白质进行分离，纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。 聚丙烯酰胺凝胶：由丙稀酰胺（Acr)单体和少量的交联剂——亚甲基双丙稀酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构。 引发剂（NH4)2S2O8在凝胶形成中提供始自由基，通过自 由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。 加速剂 TEMED 则可加快引发剂放自由基的速度。

SDS-PAGE 通常采用不连续电泳系统，通过电荷效应，浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。 SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，可使蛋白质的氢键和疏水健打开，与之形成蛋白质－SDS复合物。由于SDS带有负电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差异，使蛋白质分子在凝胶中的迁移率主要取决于它的分子量。

将玻璃夹板、电泳槽内芯、玻璃夹板依次放入槽内 § 6、加样、电泳 每块胶上，一个阴性对照，一个阳性对照 每人点1个原液，1个倍比稀释液。 1块胶／组 将玻璃夹板、电泳槽内芯、玻璃夹板依次放入槽内 （短玻板一面朝内） 插入楔型板 加注电泳缓冲液 （液面高于短玻板，低于长玻板） 拔掉梳子 每孔加样20μl （16μl裂解液＋4μl上样缓冲液，混匀） 盖好上盖，恒压电泳，40-45V 约3小时 溴酚兰前沿到底部，终止电泳。 取下凝胶，浸泡于蒸馏水中，紫外灯下检测

（五）免疫印迹（ immunoblotting ） 又称蛋白质印迹（Western blotting），是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。 免疫印迹技术结合了电泳分辨率高及免疫组化特异性强的双重优点，是目前蛋白质研究工作中的重要手段之一。

蛋白质样品经电泳分离 将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上 硝酸纤维素膜(Nitrocellulose，NC) PVDF膜（聚偏二氟乙烯） 尼龙膜、滤纸条 在膜上对蛋白质进行定性分析及定量检测

蛋白质印迹电转移 蛋白转印方法： 简单扩散、真空助溶液流、电洗脱 包括半干式转移、湿式转移等方法。 将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极。

转移单位示意图 负极（上盖） 蛋白质转移方向 正极（石墨板） 凝胶 转印膜 滤纸

§ 7、转膜 1条膜／组 取下含目的蛋白的凝胶，于转移缓冲液中平衡 15 min 用蒸馏水清洗石墨板、擦干 在石墨板（＋）上依次放置3张滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、3张滤纸 扣上转移电泳槽上盖（－），恒流下转移，0.8mA/cm2，15 min 关闭电源，取出膜，紫外灯下检测。 1条膜／组

五、注意事项 Acr, Bis具有神经毒性，实验中应带手套操作。 待分离样品的质和量直接影响电泳效果。 如待分析的蛋白质分子量大，转移时间需延长。 电泳转移操作时，确保滤纸、膜、凝胶其间无气泡存在。

六、思考与讨论 题 （1）本实验中，哪一步是成功诱导GFP基因表达的关键？为什么？ （2）免疫印迹技术的原理及半干式转移的操作要点是什么？