液相色谱的方法开发 分离方法

第一步干什么? 想办法得到各种信息 对色谱柱有足够的了解 充分了解您自己的样品 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献，如Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品

分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?

分离时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?

一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值 调节a值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度

使用文献方法 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）

色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速

反相色谱的方法开发 开发过程实例 色谱条件∶ 样品： 色谱柱：C18，4mm×30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)

改变容量因子 K' 谱图

改变选择性∶a 通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱

离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱∶离子交换法 使用反相柱 主要用于“强”阴、阳离子 离子抑制色谱法 离子对色谱法 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法 加入“对离子”，使样品呈中性

离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内

常用缓冲液及其pH值

离子抑制色谱实例 在乙腈/水及pH=7时， 多数保留时间很短，无 法完全分离。

离子抑制色谱的使用范围 如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱 使用“离子对色谱法”

在高pH值下用离子抑制 色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温 流动相：乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA 流 速：1.0ml/min 检 测：UV-240nm 样 品：巴比妥的衍生物 ① 巴比妥 ② 己琐巴比妥 ③ 甲基苯巴比妥 ④ 速可巴比妥

离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 离子对试剂的类型 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 PIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸 PIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 通常有：B5，B6，B7，B8 PIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱

离子对色谱机理

用离子对？还是离子抑制？

离子对色谱的应用 抗组胺及减充血剂药物的分析

使用五烷基磺酸盐 Packing: Bondapak C18 Column: 4 mm ID x 30cm Solvent: Methanol/H2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS 1. Maleic Acid 2. Phenylephrine 3. Phenylpropanol- amine 4. Naphazoline 5. Phenacetin 6. Pyrilamine

使用六烷基磺酸盐 1. Maleic Acid Packing: Bondapak C18 2. Phenylephrine-HCl 3. Phenylpropanolamine-HCl 4. Naphazoline-HCl 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Maleate Packing: Bondapak C18 Column: 4 mm ID x 30cm Solvent: Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS

使用七烷基磺酸盐 1. Maleic Acid 2. Phenylephrine Packing: Bondapak C18 3. Phenylpropanolamine 4. Naphazoline 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Packing: Bondapak C18 Column: 4 mm ID x 30cm Solvent: Methanol/Water with 0.005M HEPTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS

样品浓度对分析的影响

离子对色谱分析水溶性维生素

用不同的离子对试剂

离子对色谱 - 水溶性维生素

方法开发的其他因素 以上因素均影响分离度 流速对柱效的影响 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度

结论 充分用已知样品结构确定以哪种方法开始 观察流动相条件改变时色谱峰的移动 改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！ 普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他 观察流动相条件改变时色谱峰的移动 根据变化的方向及大小决定下一步干什么 改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！ 色谱柱的改变影响最大