国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心

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国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 戊型肝炎与输血安全 各位专家、领导, 余涛 2015.4 烟台 北京万泰生物药业股份有限公司 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心

戊肝病毒的发现 前苏联科学家巴拉杨的贡献: 于1981年深入阿富汗战场,搜集非甲非乙型肝炎患者标本 以身试毒,将病毒带回莫斯科 通过电镜从自己的粪便中首次观察到戊肝病毒 从Balayan粪便标本中观察到的HEV病毒颗粒

戊肝病毒是一种RNA病毒 HEV是一种直径为27-34nm、无膜的单股正链RNA病毒 ; 包括3个ORF片段; 4种基因型别,一种血清型

戊肝病毒的基因型 基因1/2型仅见于人,常污染水源引起大规模爆发 基因3/4型除感染人外,还常见于猪、鹿及其他一些哺乳动物。主要引起散发病例,分布遍及全球。 Nassim Kamar, et al. Lancet. 2012, 379: 2477

Dalton et al Lancet Inf Dis 2008 戊肝病毒主要经消化道传播,偶尔可经血传播 猪已成为卫生状况良好地区散发戊肝的主要传染源 水源的人畜粪便污染是戊肝暴发流行的主要原因 Dalton et al Lancet Inf Dis 2008

各位专家、领导, 戊型肝炎的流行情况:戊肝病毒在全球广泛传播,据估计全世界约1/3人口曾被感染过(Purcell RH, Viral hepatitis. 3rd ed. Blackswell 2005),多次引起万人以上的特大流行。 Chandra et.al, J Biosci. 2008

戊肝暴发 — 全球 2012年8月始,南苏丹戊肝爆发,截止2013年9月23号,发病12386人,死亡225人 1986-1988 中国新疆 发病119280例死亡707例,其中414例为孕妇。 1955-1956 印度新德里 发病97000例 2012年8月始,南苏丹戊肝爆发,截止2013年10月,发病超过11,000人,死亡241人 1978-1982 印度克什米尔 发病52000例 死亡1700例 2004 苏丹达尔富尔 发病2621例 死亡45例 1955-1956 吉尔吉斯斯坦 发病10812例 1990-1991 印度坎普尔 发病79091例 死亡48例 1973-1974 尼泊尔加德满都山峡 发病10000例 妊娠女性死亡30例 2007-2009 乌干达北部 发病10196例 死亡160例 1976-1977 缅甸曼德勒 发病20000 1988-1989索马里谢贝利河下游地区 11413例 死亡346例 2013年10月始,乌干达纳帕克区戊肝爆发,截止2014年2月6号,发病656人,死亡19人

戊肝暴发 — 中国 食源性戊肝暴发 时有报道。 时间 地点 病例 患病率 感染率 2010 扬州 19 16.5% 26.1% 2007 我们根据现有文献,对我国近10年报道的食源性戊肝暴发进行汇总发现,各年份、各地区均有小规模的食源性戊肝暴发。 2014年1月,我省日照地区出现一起戊肝聚集疫情。该疫情发生在中石油日照输油有限公司,公司成立于2011年,员工来自全国各地,以内陆为主。公司查体中抗-HEV IgM阳性率为10.87%(15/138),显著高于社区人群一般水平(2~4%,烟台市数据)。(疾控内部数据,未发表) 戊肝暴发 — 中国 时间 地点 病例 患病率 感染率 2010 扬州 19 16.5% 26.1% 2007 山东 7 8.3% 14.3% 2006 武义 18 20.7% nd 2005 广州 4 2.6% 19% 2004 41 14.2% 40.6% 丹东 56 15.4% 漯河 4(儿童) 2002 北京 32 1.9% 8.7% 33 2.27% 7.57% 2001 新疆 167 0.64% 2.25% 13.38% 2014年日照 食源性戊肝暴发 时有报道。 Nd:未提供数据

HEV是急性病毒性肝炎 最重要的病因 Source: R. Purcell 2008 HEV is currently the main or, in some contexts, 2nd most important cause of acute hepatitis in the developing world. Source: R. Purcell 2008

临床戊肝——中国大陆(Ⅰ) 部分地区戊肝发病率超过甲肝,病死率较高 数据来源:卫生部网站 ( http://www.moh.gov.cn/publicfiles//business/htmlfiles/mohjbyfkzj/s2907/index.htm )

临床戊肝— 中国大陆(Ⅱ) 急性肝炎 戊肝 % 六城市(92~93)* 729 90 12.3% 上海(90~94) 1054 188 17.8% 福州 (00~03)** 367 158 43.1% 香港 (02)*** 129 24 18.6% 武汉 (02-03)**** 226 43 19.0% 江苏 (05~06) 461 185 40.1% *, 朱永红,等. 中国公共卫生,2002,18:189-190; **, 郑铃,等. 中华肝脏病杂志,2005, 13:590-593; ***, Chau et al, Am J Gastroenterol. 2006, 101:292-296; ****, 江宇,等. 华中医学杂志, 2004, 28:188-189; 其余数据由厦门大学提供。

戊肝病死率居病毒性肝炎首位 图3 2006~2012年我国病毒性肝炎病死率情况 数据来源:卫生部网站-全国法定传染病疫情报告

戊肝的疾病负担较重 戊肝疾病负担重、住院时间长,居于各型病毒性肝炎之首

我国自然人群中的无症状感染 广西一般人群抗体阳性率及年阳转率 年阳转率为4.3%

江苏东台自然人群中的隐性感染与显性感染 在以4型HEV感染为主的东台,散发性戊肝显性感染约为隐性感染的1/50。 队列 戊肝病毒感染 戊型肝炎 风险 人年 感染次数 感染率 (万人年) RR (95%CI) 病例数   无抗体 4763 84 176.4 1.00 247620 93 3.8 抗体阳性 3305 31 93.8 0.53(0.35-0.80) 152542 19.5 1.3 0.34(0.21-0.55) 在以4型HEV感染为主的东台,散发性戊肝显性感染约为隐性感染的1/50。 Zhang J et al, Clin Microbio Infec, 2013; Zhu FC, et al Plos one, 2013

戊肝的临床表现 急性黄疸性肝炎 慢性戊型肝炎 药物性肝炎? 肝外症状 HEV可通过各种途径传播给人类,但大部分是不表现临床症状的,而在表现出临床症状的那部分患者中也只有小部分是我们可辨别出来的,这其中的原因包括3个:1.直到1989年在东京肝病大会上,戊肝才有了官方版姓名。我们逐渐才对戊型肝炎有了一定的了解。很长时间内戊肝被冠以非甲非乙的头衔,“隐姓埋名”了多年;2.戊型肝炎诊断技术的相对落后,没有戊型肝炎诊断试剂为临床戊肝诊断提供依据,导致许多戊型肝炎被诊断为非甲非乙或药物性肝炎;3.戊肝诊断试剂尚未普及,例如美国目前就没有批准上市的戊肝诊断试剂。所以,我们可以说戊肝已经“潜伏”于我们身边多年,但我们严重低估了戊肝。 慢性戊型肝炎 药物性肝炎? 肝外症状 Nassim Kamar, et al. Lancet. 2012, 379: 2477

戊肝对特殊人群的高危害性 孕妇特别是妊娠晚期的孕妇感染戊肝后病死率高达 20%左右 通过垂直传播途径感染戊肝病毒的围产期新生儿死 亡率较高 各种慢性肝病患者重叠感染HEV后,容易发生肝脏 失代偿,愈后普遍较差 器官移植病人或免疫缺陷病人感染HEV后可能导致 慢性化

戊型肝炎实验室诊断的临床指征 急性肝炎/黄疸 慢性肝病,病情突然变化 移植/免疫抑制治疗后ALT异常 输血后ALT异常

戊肝的感染过程 Hoofnagle, N Engl J Med , 2012;367:1237-44.

临床戊肝的诊疗指南 戊型病毒性肝炎诊断标准及处理原则GB 17011—1997 戊型病毒性肝炎诊疗规范 病原学诊断: 中国医师协会感染科医师分会 中华临床感染病杂志, 2009, 2(5): 260 病原学诊断: 抗HEV-IgM阳性,或 抗HEV-IgG由阴转阳,或 滴度由低转高,或高转低4 倍以上者 病原学诊断: 抗HEV-IgM阳性,或 抗HEV-IgG阳转,或含量 有 4倍及以上升高 血清和(或)粪便HEV RNA 阳性

戊型肝炎的血清学诊断 血清学诊断:IgM,IgG 传统试剂:采用线性表位抗原, IgG优于IgM,以新加坡Genelabs公司试剂为代表 Li et al. PLoS Pathogens, 2009 血清学诊断:IgM,IgG 传统试剂:采用线性表位抗原, IgG优于IgM,以新加坡Genelabs公司试剂为代表 新一代试剂:采用构象表位抗原,IgM优于IgG,以万泰试剂为代表

HEV构象型表位的免疫反应优势 表达HEV的 ORF2 aa459- 606,形成二聚体 二聚体与患者恢复期血清的反应性明显强于单体

HEV构象型表位的免疫反应优势 急 性 期 血 清 恢 复 期 血 清 二聚体 E2 单体 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 N 二聚体 E2 单体 急 性 期 血 清 恢 复 期 血 清

中和单抗Fab对血清的阻断 与实验感染的恒河猴系列血清的反应性 与中和单抗的反应性 恒河猴 患者 8C11和8H3识别的表位即为免疫优势表位

免疫优势构象表位的结构基础 Li et al. PLoS Pathogens, 2009;Tang et al. PNAS, 2011 二聚体的蛋白晶体结构 优势抗原决定簇的位置(粉红色区域) Li et al. PLoS Pathogens, 2009;Tang et al. PNAS, 2011

戊肝抗体的产生于消退与其他病原并无明显不同 恒河猴感染后抗体不同时间的阳性率 E2-IgG 间接法 E2-IgM 捕获法 86只实验感染恒河猴系列血清 RNA发病1周后消退 IgM阳转早,阳转率高,急性期后消退 IgG阳转早,阳转率高,持续长 传统试剂IgG阳转晚,阳转率不高,持续时间长短不一 Zhang J, et al, J Med Virol 2003 戊肝抗体的产生于消退与其他病原并无明显不同

E2-IgM的临床检测性能 E2-IgM GL-IgM Abbott-IgM 灵敏度 日本名古屋城市大学 100%(55/55) 78.2%(43/55) 复旦大学 97.3%(72/74) 70.3%(52/74) 英国皇家康沃医院 95.5%(21/22) 特异性 100%(36/36) 83.3%(30/36) 100%*(241/241) 77.6%*(187/241) *: 甲型肝炎急性期血清标本

91例急性肝炎病例,以RNA检测作为金标准,评价4种试剂的诊断灵敏度、特异性 日本名古屋城市大学,Hepatology 91例急性肝炎病例,以RNA检测作为金标准,评价4种试剂的诊断灵敏度、特异性 E2-IgM Cosmic TGH* Abbott 灵敏度 (n=55) 100% 98.20% 96.40% 78.20% 特异性 (n=36) 97.20% 83.30% TGH:日本东京总医院自行研制HEV-IgM试剂 Khan, et al. Hepatology, 2009, 50: 432A

Ge et al, Biomed Environ Sci 2007,20:521-515 病例数 E2-IgM 阳性数 GL-IgM 阳性数 甲型肝炎 241 54 戊型肝炎 74 72 52 Ge et al, Biomed Environ Sci 2007,20:521-515 E2-IgM :GL-IgM=97.3% :70.3% 灵敏度 E2-IgM :GL-IgM=100% :77.6% 特异性

E2-IgM在HEV基因3型病毒引起的戊肝急性感染病例自发病后6周内的诊断灵敏度为95% 英国皇家康沃医院, J Med Virol E2-IgM在HEV基因3型病毒引起的戊肝急性感染病例自发病后6周内的诊断灵敏度为95% Bendall, et al. J Med Virol. 2008 80:95-101

E2-IgG的实际应用性能 既往感染 E2-IgG GL-IgG 较低的检测下限 (WHO units/ml) 英国皇家康沃医院& So, we have arrived at a historic moment in infectious diseases, when the means of control is ready, but we are still not sure how to make use of it. The reason is we don’t know yet what the disease burden is. So, who are we to vaccinate. The challenge before us is therefore to determine disease burden of hepatitis E, and the answer lies to a large extent here in South Asia. E2-IgG的实际应用性能 既往感染 E2-IgG GL-IgG 较低的检测下限 (WHO units/ml) 英国皇家康沃医院& 0.023 0.12 灵敏度 < 6 weeks 100%(15/15) 73.3%(11/15) 6 W – 12 M 100%(9/9) 55.6%(5/9) > 12 months 100%(11/11) 36.4%(4/11) 新疆CDC 10 years 86%(43/50) 36%(18/50) 特异性 厦门大学 99.6%(271/272) 荷兰CDC* 97% &:Bendall, et al. J Med Virol. 2010 82:799-805 *:Bouwknegt, et al. Epidemiol Infect 2008 136:567–576.

感染戊型肝炎10年后患者血清抗病毒抗体的检测 新疆CDC, 地方病通报 感染戊型肝炎10年后患者血清抗病毒抗体的检测 试剂 检测数 阳性率 Cut off值 阳性标本OD值 阳性标本的 平均S/C.O值 低值 中值 高值 E2-IgG 50 86% 0.19 0.532 1.368 2.327 9.24 GL-IgG 36% 0.512 0.514 1.018 2.415 1.98 李新兰 等. 地方病通报 2002 17: 14-17

E2-IgG试剂体现了肠道传播病毒抗体阳性率随年龄增高的典型趋势 山东某地人群流行病学研究 E2-IgG试剂体现了肠道传播病毒抗体阳性率随年龄增高的典型趋势

与WB相比,E2-IgG灵敏度为99.5%(187/188),特异性为99.6%(271/272) 厦门大学,中国人兽共患病杂志 在460份普通人群中,E2-IgM 小于临界值的OD值取对数后呈正态分布,而阳性血清OD值的高低与其WB的反应强度正相关。 临界值 与WB相比,E2-IgG灵敏度为99.5%(187/188),特异性为99.6%(271/272) 闫强 等. 中国人兽共患病杂志 2008 24: 1087-1089

Bendall, et al. J Med Virol. 2010 82:799-805 E2 IgG 检测下限0.023 WHO units/ml GL-IgG检测下限0.12 WHO units/ml 检测戊肝发病各阶段血清标本的灵敏度 病期 E2-IgG GL-IgG < 6 weeks 100%(15/15) 73.3%(11/15) 6 weeks – 12 months 100%(9/9) 55.6%(5/9) > 12 months 100%(11/11) 36.4%(4/11) Bendall, et al. J Med Virol. 2010 82:799-805

Bendall (J Med Virol 2010): E2试剂(万泰试剂)比GL试剂更灵敏(98%比56%),在感染后更长的时间内能检出,因而检测的献血员血清阳性率更高(16.2%比3.6%)。

Ijaz博士,英国卫生保护局传 染病中心肝炎室主任: E2-IgG诊断试剂在所有比较 的试剂中灵敏度最高。 各位专家、领导, 英国卫生保护局(HPA) Ijaz博士,英国卫生保护局传 染病中心肝炎室主任: E2-IgG诊断试剂在所有比较 的试剂中灵敏度最高。

HEV Ag试剂 最近,通过重新筛选配对抗体,对原有试剂进行了改进,检测灵敏度提高了10-100倍 王佑春团队报道 HEV Ag试剂 最近,通过重新筛选配对抗体,对原有试剂进行了改进,检测灵敏度提高了10-100倍 新试剂检测二聚体重组抗原E2的下限:2.4pg/test 检测颗粒性抗原p239的下限:39pg/test

新试剂检测不同基因型病毒的下限:6.3×103 copies/mL 王佑春团队报道 新试剂检测不同基因型病毒的下限:6.3×103 copies/mL 抗原与定量PCR检测相关性比较

HEV感染恒河猴系列血清评价 原有抗原检测报道(Feng Zhang et al, 2006) 王佑春团队报道 HEV感染恒河猴系列血清评价 原有抗原检测报道(Feng Zhang et al, 2006) 抗原比RNA提前消失2-3周(RNA阳性: 5-8 周,抗原阳性:2-4 周) IgM产生后抗原检测不到 抗原阳性基本与ALT升高不交叠 抗原试剂改进(In Submission) RNA和抗原均在接种后7-10天可检出,并同时持续5-8周 抗体阳转后,依然能明显检出抗原阳性 抗原阳性期与ALT异常的时期几乎完全交叠

急性戊型肝炎中的抗原检测 2011.6-2012.5 江苏省东台市 至少一份随访血,出现至少3天的疲乏、食欲不振,ALT出现2.5倍以上升高 戊肝确诊(符合以下条件中2个以上) anti-HEV IgG 水平出现4倍以上的上升 HEV RNA阳性 anti-HEV IgM阳性 16个病例首诊血抗原均为阳性

3例IgM-、Ag+、PCR+的病例 处于感染早期 ID Days after onset ALT (ULN) IgM (S/CO IgG (WU/ml) Ag (S/CO) RNA (copies/mL) CLD00059 6 6.47 0.00 0.45 36.98 614551 101 0.67 1.25 7.83 0.27 GHG04321 5 7.14 0.77 0.51 25.42 187614 25 0.33 3.55 24.62 70 0.12 0.24 1.87 0.31 GSZ04172 3 12.84 0.06 0.09 37.26 2744038 122 0.78 1.35 95.04 0.40

3例IgM+、Ag+、PCR-的病例 抗原阳性能被12F12 Fab及HEV IgG (+)血清阻断,证明抗原阳性为特异性免疫反应检出 RNA降解 或 处于急性期晚期,RNA已消退

RNA拷贝数与Ag反应强度的关系 IgG = 311 WHO units/mL

各急性期指标在戊肝病程中的动态变化 抗原与RNA检测阳性与ALT异常均主要出现在发病后一个月内, 三者具有高度的相关性 IgM则可在血清中存在平均5个月左右

致谢!