细胞培养过程中的遗传变异 离体培养中的遗传与变异特点 体细胞变异的基础 体细胞突变体诱导与筛选的方法

遗传与变异特点 离体培养的遗传稳定性 离体培养下的变异 影响体细胞遗传与变异的因素

离体培养的遗传稳定性 离体培养的细胞学基础是有丝分裂，有丝分裂的DNA半保留复制和染色体的均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。 离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是即使发生某些变异，只需根据需要选择适当的培养方式进行离体繁殖，即可淘汰或选择变异、或分离纯合体。

离体培养下的变异特点 普遍性： 局限性： 嵌合性： 变异可发生在各种培养类型中；各种培养植物中 从表型上看，在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。 从生理生化特性上看，容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。 嵌合性： 嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞。 嵌合体可以以不同倍性的形式存在，必须分离培养才能纯化。 被仿效的译本叫做显性，另一个则叫做隐性；换句话说，根据突变是否直接影响到模式的改变，称之为显性突变或隐性突变。 如何鉴别显性突变和隐性突变    利用杂交试验的方法，可以区分显性突变还是隐性突变。以上例而言，让矮杆突变体植株与原始亲本杂交，若F1表现高杆，F2中既有高杆，也有矮杆植株，说明矮杆突变是隐性突变。若是显性突变情况又如何呢？F1表现为矮杆，F2中矮杆：高杆为3：1。

离体培养再生植株的表型变异频率 植物种类 再生植株来源 变异频率(%) 烟草 体细胞愈伤组织 10 水稻 胚愈伤组织 71.9 甘蔗 幼叶愈伤组织 >18 玉米 14 大麦 花粉植株 10－15 马铃薯 叶肉原生质体 100 菠萝 顶芽愈伤组织 7 腋芽愈伤组织 34 幼果愈伤组织

离体培养变异的影响因素 供体植物 继代培养的次数 培养基及培养方式 遗传背景 生理状态 倍性水平，二倍体比单倍体稳定 基因型 来源于茎尖的愈伤组织的DNA含量及染色体数的稳定性好于来源于薄壁细胞的 继代培养的次数 培养基及培养方式

1.8

亚二倍体是指正常的46条染色体丢失一个或多个染色体 继代次数越多，细胞变异概率越高

培养基及培养方式 不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞的分裂。 豌豆，低浓度2,4-D(0.25 mg/L)－－多倍体 高浓度2,4-D(20 mg/L)－－二倍体 激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。 蚕豆，无激素－多倍体发生频率＝6.31% 10NAA，2.5KT-单倍体＝13.3％ 培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。

体细胞变异的基础 遗传学基础 DNA在核内重复复制－－同源多倍体 硬粒小麦中胚轴培养中DNA值的变化 培养天数 不同DNA值细胞比例（％） <2C 2c~4c <8c 8c or >8c 88.3 11.7 5 80.7 16.8 2.5 13 4.8 79.5 6.6 9.1 17 9.7 81.5 7.9 0.9

体细胞变异的基础 遗传学基础 染色体断裂与重组－－非整倍体、四倍体 产生染色体结构变异的一般不能正常生长 染色体畸变中出现的双着丝粒染色体在细胞分裂后期如不能被拉断，就会在两核之间形成染色体桥，出现四倍体。

体细胞变异的基础 遗传学基础 非正常有丝分裂－－非整倍体

体细胞变异的基础 分子遗传学基础 碱基突变 DNA序列的选择性扩增与丢失 转座子活化 DNA甲基化 抗除草剂－草甘磷，3-烯醇丙酮酸莽草酸-5-磷酸合成酶 转座子活化 DNA甲基化 体细胞变异除了发生在染色体水平上，更多的是在基因水平上的变异。也就是DNA水平上的碱基突变活修饰状态的改变。 DNA序列的选择性扩增与丢失，可能是细胞在短期内为满足需要而产生足够的基因产物的一种调控手段。

突变的类型及应用 自发突变(spontaneous mutation) 诱导突变(induced mutation) 物理诱变 化学诱变 离体培养再生植株的自发变异比自然条件下的变异高得多，一般可高出几百倍 诱导突变(induced mutation) 物理诱变 化学诱变 复合因子诱变 转座子插入诱变

DNA复制中，“以假乱真”，如5-溴尿嘧啶(BU)、2-氨基嘌呤等 马来酰肼 丝裂霉素

转座子插入诱变 转座子体系--玉米的Ac/Ds系统 Ac（Activation，意为活化）。相当于一个显性因子,它位于9号染色体长臂上,Ac与Ds （Dissociation，意为离异）隔开一段距离,但却能遥控指挥Ds(Ds是不稳定的，它可以从染色体的一个位点跳到另一个位点) 转座子作用：既可直接将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。

转座子插入诱变 操作过程 成果：已在苜蓿（颜色改变）、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异植株。 采用基因转化的方法将Ac/Ds导入受体细胞 通过体细胞培养或再生植株的自交或侧交使Ac因子切除，由于转座子插入的随机性，即可在切除Ac的植株中筛选出不同变异。 成果：已在苜蓿（颜色改变）、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异植株。

突变体的应用 创造育种中间材料或直接筛选新品种 在全世界50多个国家中，已培育出1000多个由直接突变获得的或由这些突变体杂交而衍生的品种 通过体细胞诱变选育的谷类作物品种中，品质得到不同程度改良的占34.3％。 抗病，占诱变品种的1/4 耐盐 抗除草剂 耐寒 耐旱

突变体的应用 遗传研究 发育生物学研究 用于基因功能鉴定 突变DNA序列用于分子标记 用于建立器官发育模式 分析鉴定一些基因的表达与植物发育的关系 在烟草、玉米中均通过质体突变体分离鉴定了与植物叶绿体发育的基因

突变体的应用 生化代谢途径研究 根据需要建立某一代谢途径中每一个调节点的突变体。 烟草硝酸还原酶缺失突变体cnx和nia ，也可以根据需要与基因工程相结合，对一些关键调控过程进行修饰和改造，使代谢过程按照人类需要进行，因此而发展起来的新型学科领域称之为代谢工程

具有实用性的突变体 类 型 应 用 抗氨基酸及类似物突变体 高赖氨酸水稻突变体 抗病突变体 烟草抗野火病突变体 抗除草剂突变体 烟草抗“毒莠定”突变体 耐盐突变体 烟草已选择出抗盐突变体（1%~2%NaCl) 抗金属离子突变体 抗汞、铜、铝 抗逆突变体 抗旱、抗低温 营养缺陷型突变体 银杏赖氨酸营养缺陷型

直接选择法 正选择法： 用一种含有特定物质的选择培养基，在其上只有突变的细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体的办法。 小麦幼胚愈伤组织--1.4%NaCl N6培养基＝＝小麦耐盐系。 900个甘薯胚性细胞系--γ射线--2.0%NaCl==22个抗盐愈伤组织

直接选择法 负选择法（富集选择法，又称浓缩法 ）： 在特定培养基中，让正常细胞生长繁殖，突变体细胞受抑制不分裂呈休眠状态， 然后用一种能毒害正常生长细胞，而对休眠细胞无害的药物淘汰正常细胞， 再用正常培养基恢复突变体生长。 该方法主要应用于营养缺陷型突变体筛选。

间接选择法 当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法 间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。 当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法 如脯氨酸（Pro） 锦橙珠心悬浮细胞--γ射线--高浓度Pro＝＝细胞内Pro含量提高一倍＝＝耐寒愈伤及植株。 抗病突变体的筛选也常常用间接筛选的策略。

绿 岛 法 绿岛法是利用已分化组织进行筛选和鉴定的方法。 对于抗病毒突变体、抗除草剂突变体的筛选，可以采用“绿岛法”。 这种方法最早用于抗除草剂，叶片大面积枯黄，仅有少量抗除草剂突变细胞组织仍保持绿色，取这部分材料则成为很小的绿岛，因而形象地称之为“绿岛法”。 单倍体烟草植株-- γ-射线--除草剂--叶片部分变黄--取出绿色部分--愈伤组织==耐除草剂的单倍体植株==二倍体 许多重要的基因在培养细胞无组织、无器官的未分化状态下并不表达，因而对这些基因突变体无法在培养基中进行筛选。

突变体筛选程序 预 处 理 预培养 （悬浮或平板） 诱发突变 （平板培养） 高抗高产细胞株选择 （平板培养） 愈伤组织增殖 突变体鉴定 或再生植株 突变体鉴定

小结 离体培养中体细胞变异发生是普遍的，但具有局限性，变异的程度可以通过培养类型和条件进行控制。 体细胞变异可自发产生也可通过理化因子诱导产生。 利用体细胞变异可直接培养品种也可作为生物学相关研究的基础材料。 将离体培养技术与诱变技术相结合，可以提高变异频率，增加变异选择的基础材料，丰富遗传资源。

思考题 1．体外培养的变异有何特点？ 2．哪些因素会影响培养物的遗传变异？ 3．体细胞无性系变异的诱导和选择方法。 4．体细胞无性系变异的应用途径。