第八章 生物制品

第一节 生物制品基本概念 一、定义及概述 生物制品（biological product）是从微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）及其代谢产物、原虫、动物毒素、人或动物的血液或组织等直接加工制成，或用现代生物技术方法（基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程）制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂统称为生物制品。 包括各种疫苗、抗血清、抗毒素、类毒素、免疫调节剂（如胸腺肽、免疫核酸等）、诊断试剂等。

二、生物制品的分类 分类一：根据用途又可将生物制品分为预防类、治疗类和诊断类三大类制品。 预防类 治疗类制品 诊断类制品

1、预防类制品 此类制品主要用于感染性疾病的预防。常用的有如下几种 疫苗 类毒素 由有关细菌产生的外毒素经脱毒后制成的。常用的有白喉、破伤风、肉毒类毒素及葡萄球菌类毒素等 混合制剂 常用的混合制剂的有以下几种。 联合细菌 伤寒、副伤寒甲、乙联合菌苗，霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙联合菌苗。 联合病毒 麻疹、牛痘苗联合疫苗，麻疹、风疹联合疫苗，风疹、腮腺炎联合疫苗，麻疹、腮腺炎风疹联合疫苗。 细菌和类毒素混合制剂 白喉毒素类、百日咳菌苗和破伤风类毒素混合制剂 内毒素：是革兰阴性菌细胞壁的组成部分，是脂多糖（LPS）复合体 。内毒素组成随细菌属的不同而有差异。引起非特异性效应，如发热和血压突然下降。一般细菌死亡或分解时大量释放到宿主组织。能杀死这些细菌的抗生素可以造成毒素大量释放，使患者因血压急剧下降而死亡（内毒素性休克）。 外毒素：由一些革兰氏阳性菌和少量革兰阴性菌产生的毒性更强的物质。（1）大部分是多肽。加热、紫外线照射或化学物质（如甲醛）处理等可使之失活。（2）酶。溶血素，裂解红细胞，使铁离子释放，而铁离子是所有细胞包括微生物和宿主细胞生长必需的元素。（3）杀白细胞毒素，这些毒素具有损伤和破坏某些种类的白细胞。 许多外毒素经过某些化学物质（如甲醛）处理后失去活性但仍保留抗原性的外毒素称为类毒素。

2. 治疗类制品 抗血清与抗毒素 用特定抗原免疫马、牛或羊，经采血、分离血浆或血清，精制而成。抗细菌和病毒的称抗血清；抗蛇毒和其他毒液的称抗毒血清，抗微生物毒素的称抗毒素。 血液制品 人血白蛋白，人免疫球蛋白，人凝血因子，红细胞浓缩物等 噬菌体 用于裂解宿主菌，以治疗由宿主菌所引起的疾病，如痢疾杆菌噬菌体和绿脓杆菌噬菌体，可分别用于治疗菌痢和绿脓杆菌感染症，但其疗效尚难肯定。

疫苗 乙型肝炎治疗疫苗；单纯疱疹病毒疫苗；麻风病治疗疫苗；其他治疗疫苗。 抗体 抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体，单克隆抗体靶向制剂等。 细胞因子 干扰素, 白介素，集落刺激因子，红细胞生成素 重组DNA产品

细胞因子 许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效用，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括IL-1、IL-2、IFN-7、IL-6等。 作用主要表现在以下两个方面： 增强机体的抗感染能力， 增强疫苗的保护效应， 研究表明，在注射抗原的同时或预先注射细胞因子，可明显增强针对该抗原的免疫应答能力。

3. 诊断类制品

从全球体外诊断试剂市场划分区域来看，最大的体外诊断试剂市场为北美地区（份额为44%），其次是西欧市场（份额为30%），亚洲的日本和中国的占有率分别是11%和2%。虽然看起来中国所占的份额并不大，但从市场规模增速比较，我国明显高于全球的平均水平。

体外诊断指的是使用试剂对人体的各种体液、细胞、组织样本进行检测，从而判断出病情，给出治疗方案；像体检时，病原、抗体、查询血型、基因以及遗传疾病等都是通过体外诊断试剂进行检测。据统计，最终的治疗方案有三分之二是取决于诊断信息，由此可见体外诊断的重要性

如果按照诊断方式细分，体外诊断试剂可分为血液、生化、免疫、分子生物、细菌、POCT等几大方面。

体内诊断用品 用于皮内接种，以判断个体对病原的易感性或免疫状态。如锡克毒素和结核菌素等。 体外诊断用品 生物制品除体外诊断用品外，其他均直接应用于人体，故各国及世界卫生组织对其质量均有严格要求。

分类二： 1、疫苗(Vaccine)　 一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原的生物制品统称为疫苗，包括蛋白质、多糖、核酸活载体、感染因子等。

2、抗毒素及免疫血清(Antitoxin and Antisera)　 由特定抗原免疫动物所得由血浆或血清制成；称抗毒素或免疫血清。 如破伤风抗毒素、抗狂犬病血清等，用于治疗或被动免疫预防。

3、血液制品(Blood Products) 　由健康人的血浆或特异免疫人血浆分离、提纯或由重组ＤＮＡ技术制成的血浆蛋白组分或血细胞组分制品, 如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子(天然或重组的)、红细胞浓缩物等,用于诊断、治疗或被动免疫预防。

4、细胞因子(Cytokines) 　 许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效用，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括IL-1、IL-2、IFN-7、IL-6等。 作用主要表现在以下两个方面： 增强机体的抗感染能力， 增强疫苗的保护效应， 研究表明，在注射抗原的同时或预先注射细胞因子，可明显增强针对该抗原的免疫应答能力。

5、诊断制品(Diagnostic Reagents)　 （1）体外诊断制品:由特定抗原、抗体或有关生物物质制成的免疫诊断试剂或诊断试剂盒,如伤寒、副伤寒、变形杆菌诊断菌液,沙门氏菌属诊断血清,ＨＢｓＡｇ酶联免疫诊断试剂盒等,用于体外免疫诊断;

（2）体内诊断制品:由变态反应原或有关抗原材料制成的免疫诊断试剂,用于皮内接种等。 如卡介菌纯蛋白衍生物(ＢＣＧ-ＰＰＤ)、布氏菌纯蛋白衍生物(ＲＢ-ＰＰＤ)、锡克实验毒素、单克隆抗体等,用于体内免疫诊断。

6、其它制品 由有关生物材料或特定方法制成,不属于上述5类的其他生物制剂,用于治疗或预防疾病。如治疗用Ａ型肉毒素制剂、微生态制剂和卡介菌多糖、核酸制剂等。

第二节 疫苗及其分类 凡接种机体后能产生自动免疫和预防疾病的一类生物制剂均称为疫苗（vaccine） . 细菌性菌苗 病毒性疫苗 寄生虫性虫苗 治疗性疫苗（肿瘤、过敏和一些传染性疾病） 生理调控疫苗（如促进生长和控制生殖等）

根据疫苗抗原的性质和制备工艺，疫苗又分为 活疫苗（live vaccine） 死疫苗（killed vaccine） 基因疫苗（genetic vaccine） 一种疫病究竟以哪类疫苗最为有效可行，取决于该疫病特点，包括流行病学、病原理化特性、致病机理和免疫特点以及各种技术手段是否可行。

活疫苗 活疫苗可以在免疫动物体内繁殖； 能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应； 免疫力持久，有利于清除局部野毒； 产量高、生产成本低。 有毒力增强和返祖危险； 有不同抗原的干扰现象； 要求在低温、冷暗条件下运输和储存。

死疫苗 死疫苗不能在免疫动物体内繁殖，比较安全，不发生全身性副作用，无毒力返祖现象； 有利于制备多价或多联等混合疫苗； 制品稳定，受外界环境影响小，有利于保存运输。 疫苗免疫剂量大，生产成本高，需多次免疫 只能诱导机体产生体液免疫和免疫记忆，故常需要用佐剂或携带系统（deliver system）来增强其免疫效果。

基因疫苗 基因疫苗不能在机体增殖，但它可被细胞吸纳，并在细胞内指导合成疫苗抗原 体液免疫 细胞免疫反应，尤其是细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应

不 同 疫 苗 特 性 比 较 死疫苗 DNA疫苗 活疫苗 可刺接抗原在细 中复制 胞内合成 无毒，不返强 可诱导细胞免疫 免疫反应不太全 可在宿主细胞中复制 毒力降低 免疫反应比较全面 免疫剂量小 免疫保护期长 死疫苗 不能在宿主细胞 中复制 无毒，不返强 免疫反应不太全 面 不会传染给其它 个体 制备技术相对容 易 DNA疫苗 可刺接抗原在细 胞内合成 可诱导细胞免疫 制备技术容易标 准化

疫 苗 研 究 技 术 活疫苗 死疫苗 DNA疫苗 完整病原体疫苗 蛋白基础疫苗 Viral delivery 经典策略----病毒 重组病毒 重组病毒载体 经典策略----细菌 重组细菌 重组细菌载体 死疫苗 完整病原体疫苗 蛋白基础疫苗 肽基础疫苗 多糖基础疫苗 抗独特型疫苗 DNA疫苗 “Naked” DNA Viral delivery Bacterial delivery

弱毒疫苗（attenuated vaccine） 微生物自然强毒株通过物理、化学或生物的连续传代和筛选培育而成或从自然界筛选的具有良好免疫原性的自然弱毒株，经培养增殖后制备的疫苗 丧失或减弱对原宿主动物致病力，但仍保存良好免疫原性和遗传特性的毒株

重组活疫苗 （recombinant live vaccine） 通过基因工程技术，将病原微生物致病性基因进行修饰、突变或缺失，从而获得弱毒株。 由于这种基因变化，一般不是点突变（经典技术培育的弱毒株基因常为点突变），故其毒力更为稳定，返突变机率更小，如猪伪狂犬病基因缺失疫苗。

基因工程活载体疫苗 （genetic engineering live vector vaccine） 将致病性微生物的免疫保护基因插入到载体病毒或细菌（通常为疫苗毒（菌）株）的非必需区，构建成重组病毒（或细菌），经培养后制备的疫苗。 该类疫苗不仅具有活疫苗和死疫苗的优点，而且对载体病毒或细菌以及插入基因相关病原体的侵染均有保护力。 同时，一个载体可表达多个免疫基因，可获得多价或多联疫苗。

病毒复制非必需片段基因鉴定 病毒复制非必需片段基因克隆 外源基因插入非必需片段基因中间(即重组载体) 将病毒基因和重组载体基因共转染至细胞，同源重组，产生感染性病毒粒子 筛选稳定的重组病毒 重组病毒

重 组 病 毒 载 体 痘病毒载体 (fowlpox, canarypox) 疱疹病毒载体 杆状病毒载体 腺病毒载体 RNA病毒 NDV， PRRSV，Poliovirus Sindbis virus (Alphaviruses)

痘 病 毒 载 体 宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区基因，易于构建和分离重组病毒，适于插入多个外源基因(40kb)，对插入的外源基因有较高的表达水平。 抗原性稳定，免疫原性持久，能够同时诱发体液和细胞免疫，相对安全。 痘苗病毒在种痘后局部反应较大，在人接种后有百万分之一发生全身性发痘和种痘后脑炎等并发症倾向。 鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、猪痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒 禽类痘病毒，由于用该病毒接种哺乳动物后，可以引起顿挫型感染，但却可以持续表达外源基因，并且不影响再次接种。（鸡痘病毒）

痘病毒载体中表达的外源基因 HIV gag/pol ， core，gp160 ，env NDV HA/NA，Fusion， Fusion/HA/NP PRV gp50/gp63 ,gp50/63/I/X Measles F/HA ,Fusion Rabies G Influenza HA IBDV VP2 FLV env 

腺 病 毒 载 体 人Ad2和Ad5 ：外源基因容量为20kb左右。 E3：病毒复制的非必须区，允许插入的外源基因的最大长度为4.0Kb。外源基因一般不需要加基因表达调控元件，利用腺病毒本身的调节元件，即外源基因可插在E3启动子后,在感染早期有效表达。[HIV-1、狂犬病毒] E1：为病毒复制必须区。缺失E1区的人腺病毒必须在特殊的工程细胞中（比如293细胞系（人胚肾细胞））或非缺失的腺病毒辅助下才能复制增殖，因此称为病毒缺陷型载体。

腺 病 毒 载 体 优点 腺病毒比较安全。 腺病毒的靶细胞范围广: 复制分裂细胞、非复制分裂细胞。 腺病毒容易制备，对热不敏感，高滴度增殖。 腺病毒可以在肠道及呼吸道繁殖，能诱导粘膜免疫，能制成 药囊经口服途径接种以预防消化道及呼吸道感染。 Ad2、Ad5等启动子较强，能高水平表达外源基因，特别是换 以更强的启动子如CMV早期启动子后，更可明显提高外源基 因的表达水平。

疱 疹 病 毒 载 体 基因组较大，约150kb，含70个编码基因，其中至少20%的基因是非必需基因，可容纳多个外源基因的插入。 大多数疱疹病毒的宿主范围很窄，其重组病毒的使用不会产生流行病学方面的不良后果(伪狂犬病毒除外) 。 许多疱疹病毒经粘膜途径感染，构建的载体活疫苗可经粘膜途径提呈抗原，诱导特异性粘膜免疫。 疱疹病毒作为活载体表达外源基因作为疫苗的研究：单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、牛疱疹病毒I型、马疱疹病毒I型、传染性喉气管炎病毒

活 细 菌 疫 苗 研 究 技 术 重经典策略--细菌 相对较难 重组细菌 比重组病毒困难 重组细菌载体 粘膜免疫

细菌性活载体 格氏链球菌 、木糖链球菌：人的皮肤共栖菌，可作为表面定居的融合蛋白载体 乳酸杆菌：肠道和阴道内的共栖菌，但出现时间很短。 肠道菌（大肠杆菌、霍乱弧菌、结肠耶耳森氏菌、志贺氏菌） 大肠杆菌/TGEV S蛋白的融合蛋白，CS31A: 腹腔注射免疫鼠（加佐剂）刺激产生显著的血清抗体应答。 大肠杆菌/艾美球虫子孢子蛋白的118氨基酸与β-半乳糖苷酶融合:接种鸡，可产生保护性免疫应答。 4. 沙门氏菌

沙门氏菌活疫苗载体特性 能运送抗原至肠道淋巴组织，并引起分泌免疫反应，其中分泌性IgA浸润所有粘膜表面及外分泌腺体的分泌物中。 伤寒沙门氏菌在人体、鼠伤寒沙门氏菌在小鼠能在寄主肠道中定居，并在肠道淋巴组织、肝和脾中增殖。 沙门氏菌人工突变后，它们仍能在肠道淋巴组织中定居。 这些特征使减毒沙门氏菌可能作为表达各种定居因子、毒性抗原基因的载体，来递呈这些抗原到肠道淋巴组织。

几种沙门氏菌活载体表达系统 营养缺陷质粒补救系统：该系统的寄主是某一营养代谢物的染色体突变株，而转移质粒则带有与寄主突变互补的非同源基因。 整合表达系统：即将外源基因整合到载体的染色体中。 细胞表面表达系统：即将外源基因产物表达到载体细胞表面，有利于与免疫系统接触。 鞭毛表达系统：由于鞭毛是存在于细胞表面的运动器，与鞭毛蛋白融合在一起的抗原蛋白也将存在于细胞表面，同样有利于与宿主的免疫系统接触。

病毒抗体复合物疫苗 （virus-antibody complex vaccine） 该类疫苗由特异性高免血清或抗体与适当比例的相应病毒组成。 可以延缓病毒释放，提高疫苗安全性和免疫效果，其关键是病毒与抗体的比例要适度。 目前，已研制成功并被批准投放市场的有传染性法氏囊病毒—抗体复合物疫苗（美国）。

灭活疫苗（inactived vaccine） 该类疫苗由完整病毒（或细菌）经灭活剂灭活后制成，其关键是病原体灭活。 既要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性，又要保持病原体免疫原性。 目前，常用的灭活剂有甲醛、乙酰乙烯亚胺（AEI）、乙烯亚胺（BEI）和β-丙酸内酯等

亚单位疫苗（subunit vaccine） 是指病原体经物理或化学方法处理，除去其无效的毒性物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗。 病原体的免疫原性结构成分包含多数细菌的荚膜和鞭毛、多数病毒的囊膜和衣壳蛋白，及有些寄生虫虫体的分泌和代谢产物，经提取纯化，或根据这些有效免疫成分分子组成，通过化学合成，制成不同的亚单位疫苗。 人工合成物纯度高，使用安全。 肺炎球菌囊膜多价多糖疫苗 流感血凝素疫苗 牛和犬的巴贝斯虫病疫苗等

recombinant subunit vaccines 重组亚单位疫苗 recombinant subunit vaccines 用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链，加入佐剂即制成基因工程重组亚单位疫苗。

优点： 安全性好：不含传染性材料，接种后不会发生急性、持续或潜伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情况。 减少或消除了常规疫苗有害的反应原：热原、变应原、免疫抑制原等 稳定性好：便于保存和运输，产生的免疫应答可以与感染产生的免疫应答相区别，因此更适合于疫病的控制和消灭计划。 将高度危险和致病的病原体的免疫原性蛋白质编码基因转移到不致病而且无害的微生物，用于大量生产，安全性更好。 用于外来病原体和不能培养的病原体，扩大了用疫苗控制疫病的范围。

原核生物：E.coli；枯草杆菌（Bacillus subtilis） 表达系统： 原核生物：E.coli；枯草杆菌（Bacillus subtilis） 真菌 昆虫细胞 哺乳类细胞 关键：研究和了解在各种表达系统中基因表 达和产物稳定性的调节和控制参数

抗独特型疫苗（ant-idiotypic vaccine） 根据免疫网络学说原理，利用第一抗体分子中的独特抗原决定簇（抗原表位）所制备的具有抗原的“内影像”（internal image）结构的第二抗体。 该抗体具有模拟抗原的特性，故称之为抗独特型疫苗。 它可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，主要适用于目前尚不能培养或很难培养的病毒，及直接用病原体制备疫苗有潜在危险的疫病。

DNA 疫 苗 基因疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。 裸DNA (Naked DNA) 病毒携带体（Viral delivery） 细菌携带体（Bacterial delivery）

基因疫苗免疫机理 基因疫苗被注入机体并吸收入宿主细胞后，病原体抗原的基因片段在宿主细胞内得到表达并合成抗原，这种细胞内合成的抗原经过加工、处理、修饰提呈给免疫系统，激发免疫应答。其刺激机体产生免疫应答的过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种。

研制基因疫苗的基本步骤 ① 目的基因的分析 ② 选择合适的表达载体 ③ 测序确认编码序列 ④ 体外转录／翻译验证试验 ⑤ 动物试验 ⑥ 结果评价

转基因植物疫苗（transgenic plant vaccine） 转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了 免疫学活性，注入动物体内能产生特异性抗体； 用转基因植物组织饲喂动物，转基因植物表达 的抗原递呈到动物的肠道相关淋巴组织，产生 粘膜和体液免疫应答。 食用疫苗（edible vaccine）

转基因植物基因工程疫苗的表达系统 1. 整合表达系统： 1. 整合表达系统： 把编码病原体保护性抗原基因导入植物细胞内，并整合到细胞染色体上，形成表达疫苗的植物品系。 2. 瞬时表达系统： 用植物病毒为载体，将编码疫苗抗原的基因插入植物病毒基因组中。再用此重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达。

按疫苗抗原种类和数量，疫苗又可分为单（价）疫苗、多价疫苗和多联（混合）疫苗 单（价）疫苗（univalent vaccine）：利用同一种微生物菌（毒）株或同一种微生物中的单一血清型菌（毒）株的增殖培养物制备的疫苗称为单（价）疫苗 多价疫苗（polyvalent vaccine）：指用同一种微生物中若干血清型菌（毒）株的增殖培养物制备的疫苗。 多价疫苗能使免疫动物获得完全的保护力，且可在不同地区使用。 钩端螺旋体二价及五价活疫苗、口蹄疫A、O型鼠化弱毒疫苗等。

混合疫苗（mixed vaccine）：又称多联疫苗，指利用不同微生物增殖培养物，按免疫学原理和方法组合而成。 接种动物后，能产生对相应疾病的免疫保护，具有减少接种次数和使用方便等优点，是一针防多病的生物制剂。

按疫苗病原菌（毒）株的来源，疫苗又有同源疫苗和异源疫苗之分 同源疫苗（homologous vaccine）：指利用同种、同型或同源微生物株制备的，而又应用于同种类动物免疫预防的疫苗。 异源疫苗（heterlogous vaccine）： ①用不同种微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中不含有病原体产生抵抗力。如犬在接种麻疹疫苗后，能产生对犬瘟热的抵抗力。 ②用同一种中一种型（生物型或动物源型）微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原体的抵抗力。如接种猪型布鲁氏菌弱毒菌苗后，能使牛获得对牛型和使羊获得对羊型以及使绵羊获得对绵羊型布氏鲁菌病的免疫力。

第三节 疫苗制造基本程序

通常，癌症疫苗GUCY2C接种小鼠后，T细胞型或B细胞不会产生多大的免疫应答。然而，当研究人员将疫苗链接到另一个肽S1（S1有效地激活T辅助细胞），GUCY2C疫苗功效被加强，他们能够看到GUCY2C活化细胞毒性T细胞和B细胞。 事实上，GUCY2C疫苗S1组合改善小鼠癌症存活时间至几个月，而单用GUCY2C疫苗只有数天。事实上，许多小鼠治愈了它们的疾病。当Snook博士测试另外两种肽，一种是乳腺癌（Her2），一种是黑素瘤（Trp2），他看到了相似的结果，这表明辅助T细胞的选择性失活在许多癌症疫苗接种中存在。

研究者通过设计一种DNA疫苗，能专门针对TEM1（肿瘤内皮标志物），TEM1是过度表达在肿瘤，低表达在正常组织中的蛋白质。研究证明，通过靶向TEM1，疫苗可以减少肿瘤血管生成，增加肿瘤的缺氧，降低肿瘤的生长，Andrea Facciabene博士表示：我们的研究结果证实，我们直接针对肿瘤血管，也间接地通过抗原扩散，杀伤肿瘤细胞。

内容 细菌性灭活疫苗制造 细菌性活疫苗制造 病毒疫苗的制造

细菌性灭活疫苗制造

灭活细菌疫苗通用制造程序 菌种的选择 菌液培养 灭活 配苗 浓缩 一、细菌性灭活疫苗制造 细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多， 菌种的选择 菌液培养 灭活 配苗 浓缩 细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多， 但制造的基本程序差别不大。 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗

基本流程 菌液 灭活 原料 灭活菌液 佐剂 配置 + 乳 化 分装和保存

一、细菌性灭活疫苗制造 各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （一）菌种与种子 1.菌种 制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。 各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。 2.种子培养 将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。 种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。

一、细菌性灭活疫苗制造 大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机械化或自动化的培养方式。 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （二）菌液培养 大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机械化或自动化的培养方式。 机械化或自动化的培养方式通称为反应缸培养法，可供选择的菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。 菌液培养也可采用固体培养法，该方法易获得高浓度的细菌悬液，易稀释成不同浓度，且含培养基的成分较少，所以比较适用于制备诊断用的抗原。

一、细菌性灭活疫苗制造 灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行，几种灭活菌苗的灭活方法如表所示。 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （三）灭 活 灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行，几种灭活菌苗的灭活方法如表所示。 表 几种灭活菌苗的灭活方法

一、细菌性灭活疫苗制造 为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （四）浓 缩 为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。 常用的浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法 离心沉降法 羧甲基纤维沉淀法 以上方法可使菌液浓缩一倍以上。 此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐酸—食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。

一、细菌性灭活疫苗制造 由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。 菌种的选择 菌液培养 灭活 浓缩 配苗 （五）配苗与分装 由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。 氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。 有的厂油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、 11.4m1Span-85、3.6ml Tween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。 配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。

细菌性活疫苗制造

二、细菌性活疫苗制造 细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。 菌种的选择 菌液培养 浓缩 配苗 细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。 （一）菌种与种子 弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。 菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。 将检定合格的菌种接种子于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即可作为种子液。 种子液通常在0～4C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。

二、细菌性活疫苗制造 如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液 菌种的选择 菌液培养 浓缩 配苗 （二）菌液培养 按1%～3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求进行培养。 如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液 如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗下制成菌液 菌液于0～4C暗处保存，待抽样经纯粹、活菌数等检查合格后使用。

二、细菌性活疫苗制造 菌种的选择 菌液培养 浓缩 配苗 （三）浓缩 为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2% ～0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。 （四）配苗与冻干 经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。 分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。

流程图——细菌疫苗制造工艺流程 蛋白质、肉浸液等原料 培养基 细菌分离 菌 种 弱毒菌种 配置、灭菌 鉴定 减毒 检验 配制 灭菌 原 料 原 料 佐 剂 灭活菌液 配苗、乳化 灭活疫苗 培 养 菌苗原液 配 苗 活疫苗 保护剂 菌 液 分装、冻干 分 装 灭活 活化 种子

病毒疫苗制造 病毒性禽胚培养疫苗制造 病毒性细胞培养疫苗制造 病毒性动物组织疫苗制造

一、病毒性禽胚培养疫苗制造 鸡胚选择 种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和疱疹病毒等一类生物制品，目前仍然利用禽胚特别是鸡胚制备，如鸡新城疫苗、禽流感疫苗、犬瘟热鸡胚弱毒疫苗等。 禽胚疫苗生产的原材料来源方便、质量比较容易控制，制造程序简单，不需要过高的设备条件，生产的疫苗质量可靠。 （一）鸡胚选择 受精卵应来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。 从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接毒培养。

一、病毒性禽胚培养疫苗制造 鸡胚选择 种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 （二）种毒与毒种继代 目前适应于鸡胚的种毒多系弱毒，包括自然弱毒与人工培育的弱毒两类。各种制苗用的种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保存，保存的种毒多为冻干毒。 冻干毒种需按规定要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定符合标准后方可作力生产疫苗的毒种，毒种检定内容包括无菌检验、毒价测定和其他项目的检定等。

一、病毒性禽胚培养疫苗制造 鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。 鸡胚选择 种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 （三）接毒与收获 1.接毒 鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。 接种途径：绒毛尿囊膜接种 11~12日龄胚 尿囊腔接种 9~11日龄胚 羊膜腔接种 10~12日龄胚 卵黄囊接种 5~8日龄胚 如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10-3稀释毒种0.1ml，后者接种10-4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。

2.培养收获 鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标准与内容物依不同的病毒和不同的疫苗而异。 如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相对湿度60%~70%条件培养增殖，收集接毒后24~48h内死亡胚，置0~10C冷却4~24h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿苗用。 也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻干苗。 鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则收集接毒后48~120h内死亡的鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用。

一、病毒性禽胚培养疫苗制造 按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进行配苗。 1.湿苗 鸡胚选择 种毒与毒种继代 接毒与收获 配苗 （四）配 苗 按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进行配苗。 1.湿苗 通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素500~1000U，放置0~10C 冷暗处处理后分装。 2.冻干苗 经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素500~1000U，混合后分装冻干。 3.灭活苗 收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液，按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫苗，放置4-10C保存。

流程图——病毒性禽胚疫苗制造工艺流程 受精卵 毒 株 培育 鉴定 接种 禽 胚 种 子 种 毒 扩增 收获 含病毒尿囊液或禽胚组织 毒 株 培育 鉴定 接种 禽 胚 种 子 种 毒 扩增 收获 含病毒尿囊液或禽胚组织 含病毒悬液 原 料 原 料 灭活 配制 纯化病毒悬液 灭活病毒液 配制 保护剂 配 苗 配苗、乳化 佐 剂 分装、冻干 分 装 检验 检验 活疫苗 灭活疫苗

二、病毒性细胞培养疫苗制造 种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗 细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造程序既有相同之处，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细胞及细胞培养方法也有所不同 （一）种毒与毒种继代 用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门检定分发。 领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种，制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种，或为冻干毒种。

二、病毒性细胞培养疫苗制造 制造疫苗用的细胞大体为原代细胞和传代细胞两类，根据病毒种类、疫苗性质与工艺流程选择不同的细胞。 种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗 （三）细胞制备 制造疫苗用的细胞大体为原代细胞和传代细胞两类，根据病毒种类、疫苗性质与工艺流程选择不同的细胞。 选择的依据包括：病毒的适应性高、毒价高、细胞来源方便、制备简单、生命力强。 如猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞疫苗采用犊牛睾丸原代细胞；脊髓灰质炎活疫苗选择vero细胞；狂犬病弱毒细胞适应疫苗采取BHK21细胞增殖病毒等。 培养细胞和增殖病毒用的营养液又称培养液，通常分为细胞培养用的生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的之处通常只是生长液内含有5%-10%的血清；维持液血清浓度为2%-5%。 不同细胞所需的营养成分和生长条件不尽相同。 目前常用的细胞培养方法为静止培养和转瓶培养，至于微载体培养和悬浮培养在我国尚处于试验之中。

二、病毒性细胞培养疫苗制造 种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗 （四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步之分，前者在细胞分装同时或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%-2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现70%-85%以上细胞病变时即可收获。 病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后供配苗用。

二、病毒性细胞培养疫苗制造 种毒与毒种继代 细胞制备 接毒与收获 配苗 （五）配 苗 1．灭活疫苗 不同灭活剂对不同病毒的作用也不同。向细胞毒液内按规定加入灭活剂，在一定的温度下作用一定的时间，有的灭活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。 2．冻干苗 细胞毒液内按比例加入保护剂或稳定剂，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。

流程图——病毒性细胞疫苗制造工艺流程 动物或胚胎 毒 株 组 织 原 料 培育 鉴定 配制 剪碎 消化 种 毒 细胞悬液 细胞培养液 扩增 毒 株 组 织 原 料 培育 鉴定 配制 剪碎 消化 种 毒 细胞悬液 细胞培养液 扩增 鉴定 种 子 生长细胞 传代细胞 原 料 培养 收获 原 料 原 苗 灭活病毒 配制 灭菌 灭活 配制 配 苗 （混匀、乳化） 保护剂 配 苗 佐 剂 分装、冻干 分 装 检验 检验 活疫苗 灭活疫苗

三、病毒性动物组织疫苗制造 动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗 病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病毒的量却有很大的差异，利用病毒增殖迅速、含毒量高的组织制造的疫苗称为组织疫苗(tissue vaccine)。 动物组织疫苗包括动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。 （一）动物选择 动物质量直接影响到组织疫苗的质量，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用，动物必须符合下列标准： (1)应该是清洁级(二级)以上的等级实验动物，即无规定的人兽共患性病原体动物； (2)应是对所接种病毒易感性高的动物，即在品种、年龄和体重方面合乎要求的实验动物。

三、病毒性动物组织疫苗制造 动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗 （二）种毒与接种 种毒既可用抗原性优良、致死力强的自然毒株脏器组织毒或强毒株增殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。无论何种种毒都须经纯粹、抗原性和免疫原性检查合格后使用。 接种途径依病毒性质和目的而异，例如猪瘟结晶紫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾淋毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内途径感染。 几种动物常用的接种途径如下： 1. 脑内注射：颅前后中线5mm平行线与瞳孔横线交叉处。 2. 静脉注射：家兔由耳静脉注入；鸡自翅下肢静脉注入。 3. 肌肉注射：选择腿部、胸部、臀部等肌肉丰满处注射。 4. 皮下注射：家兔和豚鼠可选择在腹部或后腿内注射。 5. 腹腔注射：家兔与豚鼠可选腹股沟处刺入腹腔。

三、病毒性动物组织疫苗制造 动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗 （三）观察与收获 动物在接种感染后应每天观察和检查规定的各项指标，指标或项目因不同病毒而异。常规观察、检查的项目如食欲、精神和活动状态、体温、粪便、尿和血液变化等。 根据观察的征象和检查的结果选出符合要求的发病动物按规定方式剖杀，采取收集含毒量高的器官组织。如猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液制备；兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产；狂犬病疫苗利用发病羊的羊脑组织制造。

三、病毒性动物组织疫苗制造 1．组织灭活疫苗 动物选择 种毒与接种 观察与收获 配苗 （四）制 苗 1．组织灭活疫苗 采取收获的组织经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液和灭活剂（甲醛、酚、结晶紫等）制成匀浆，然后按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活。如狂犬病疫苗配制按脑组织1:4加入含有甘油及1%酚蒸馏水，于360.5C灭活7天制成；猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份，结晶紫甘油溶液1份混合，于37C~38C灭活6~8天。 2. 弱毒组织疫苗 在无菌操作下剔除脏器上的脂肪与结缔组织等，称重后剪碎，加入适最保护剂制成匀浆，然后滤过扣除残渣量，再按滤液中的实际组织量计算稀释倍数，加入余量保护剂和青链霉素500~1000U(g/ml)，充分摇匀后置0~4C冷暗处处理一定时间后作无菌检验与毒价测定。合格者进行分装，冷冻真空干燥制成冻干疫苗。

流程图——病毒性组织疫苗制造工艺流程 动 物 毒 株 培育 鉴定 接种 感染动物 种 子 种 毒 扩增 收获 含病毒组织 含病毒悬液 原 料 毒 株 培育 鉴定 接种 感染动物 种 子 种 毒 扩增 收获 含病毒组织 含病毒悬液 原 料 原 料 灭活 配制 纯化病毒悬液 灭活病毒液 配制 保护剂 配 苗 配苗、乳化 佐 剂 分装、冻干 分 装 检验 检验 活疫苗 灭活疫苗

影响疫苗质量的因素 毒种：毒种的优劣不仅影响疫苗的产量，而且也影响疫苗的质量，毒种不纯会产生相互干扰，减毒活疫苗毒种若毒力回升易造成事故，因此毒种的选择应挑选那些致病性低，免疫效价高而持久，抗原谱广的，易增殖，便于生产，可在传代细胞上传代的毒种。 培养病毒的细胞：细胞若有潜在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原体污染均不能用作疫苗生产。对此因素应严格检查。此外若细胞本身发生转化后，不宜于制备活疫苗，只能制备一些灭活疫苗或亚单位疫苗。 培养液：培养细胞的营养液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常会出现某种程度的过敏反应，为此，应尽量使细胞适应于无血清蛋白的培养基中，以消除过敏源。 甲醛灭活剂的使用：甲醛能使病毒灭活，但仍保持其抗原性，因此普遍用来制备灭活病毒疫苗，但要控制含量。

获得质量优良、安全的产品，关键环节如下 1. 选择优良的菌种和毒种，并保持其稳定性； 2. 选用适当的培养繁殖细菌与病毒等微生物的方法，包括优良的培养基、合乎要求的最好是标准化的实验动物、禽胚及细胞； 3. 熟练掌握制品的生产工艺； 4. 准确掌握产品的检验方法和判定标准，严格按标准进行质量检定。