第十四章 细胞增殖调控与癌细胞 细胞增殖是通过严格调控的细胞周期来实现的，在细胞周期的不同阶段有一系列检查点对该过程进行严密监控。不然，不受约束而生成的细胞将被机体免疫系统所清除，或者癌变，转化为癌细胞。癌细胞不仅表现出增殖失控，同时还具有侵润和转移的特征，最终导致个体的死亡。 第一节 细胞增殖调控 第二节 癌细胞

第一节 细胞增殖调控 一、MPF的发现及其作用 二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系 三、周期蛋白 四、CDK和CDK抑制因子 第一节 细胞增殖调控 一、MPF的发现及其作用 二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系 三、周期蛋白 四、CDK和CDK抑制因子 五、细胞周期运转调控 六、其他因素在细胞周期调控中的作用

一、MPF的发现及其作用 MPF（maturation- /mitosis- / M-phase-promoting factor）：即（卵细胞）成熟促进因子，或细胞有丝分裂促进因子，也称M期促进因子，在细胞周期调控中起重要作用。 PCC（premature chromosome condensation）：即早熟染色体凝缩，主要是指与M期细胞融合的间期细胞（G1、S和G2）发生的形态各异的染色体凝缩。G1期PCC为细单线状（因DNA未复制），S期PCC为粉末状（因DNA由多个部位开始复制），G2期PCC为双线染色体状（说明DNA复制已完成），这样的形态变化可能与DNA复制状态有关。 M期细胞中可能存在细胞有丝分裂促进因子：M期细胞可以诱导PCC，暗示在M期细胞中可能存在一种诱导染色体凝缩的因子，称为细胞有丝分裂促进因子（MPF）。

M期细胞与G1（A）、S（B）和G2（C）期细胞融合诱导早熟染色体凝缩（PCC）（图14-1）

成熟卵细胞细胞质移植发现成熟促进因子的存在：两位科学家分离出第Ⅳ期等待成熟的非洲爪蟾卵母细胞，并用孕酮进行体外刺激，诱导卵母细胞成熟，然后进行细胞质移植实验，他们发现，在成熟的卵细胞的细胞质中必然有一种物质可以诱导卵母细胞成熟，即成熟促进因子（MPF）；后来还证明，在成熟卵细胞中，MPF已经存在，只需通过翻译后修饰即可转化为活性状态的MPF。 1998年分离获得了MPF：1998年，科学家们以非洲爪蟾卵为材料，分离获得了微克级的纯化MPF，并证明其主要含有p32和p45两种蛋白，并且是一种蛋白激酶。

非洲爪蟾卵细胞成熟过程（Ⅰ~Ⅵ）、受精和第一次卵裂示意图（图14-2）

成熟卵细胞细胞质移植发现成熟促进因子（ MPF ）的存在（图14-3）

二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系 （已知）非洲爪蟾卵：MPF ＝ p32 ＋ p45；MPF是激酶 裂殖酵母：cdc2（基因）→ p34cdc2（蛋白） p34cdc2激酶→调控G2/M转换；p34cdc2 ＋ p56cdc13。cdc即细胞分裂周期之缩写。 芽殖酵母：cdc28（基因）→ p34cdc28（蛋白） p34cdc28激酶→调控G1/S和G2/M转换；p34cdc28 ≈p34cdc2（同源物）。 p34cdc2 ≈ p32（同源物）。 海胆卵：含量随细胞周期进程变化而变化的蛋白质即周期蛋白（cyclin），cyclinB是MPF的另一种主要成分；cyclinB ≈p56cdc13（同源物）。 结论：MPF ＝ 催化亚基单位 （CDK）＋ 调节亚单位（Cyclin）。CDK为周期蛋白（cyclin）依赖性蛋白激酶

三、周期蛋白 周期蛋白（cyclin）：指含量随细胞周期进程变化而周期性变化的蛋白质，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个细胞周期中又重复这一消长现象。 周期蛋白有多种：酵母中的周期蛋白有Cln1~3、Clb1~6；哺乳动物细胞中的周期蛋白A1~2、B1~3、C、D1~3、E1~2、F、G、H、L1~2、T1~2等。 周期蛋白框（cyclin box）：指所有周期蛋白中都存在的约由100个残基组成的相当保守的氨基酸序列，其功能是介导周期蛋白与CDK结合。 破坏框/降解盒（destruction box）：指M期周期蛋白近N端含有的一段由9个氨基酸残基组成的特殊序列（RXXLGXIGX），其功能是参与泛素依赖性的cyclinA和B的降解。在破坏框之后有一段约40个氨基酸残基组成的Lys（K）富集区。 PEST序列：指G1期周期蛋白的C端含有的一段特殊的PEST氨基酸序列，其功能可能与G1期周期蛋白的更新（降解）有关。 不同的Cyclin-CDK复合体表现不同的CDK活性：不同的周期蛋白在细胞周期中表达的时相不同，并通过不同的周期蛋白框与不同的CDK结合，组成不同的cyclin-CDK复合体，表现出不同的CDK活性。

周期蛋白含量随细胞周期的变化

部分周期蛋白分子结构特征（图14-4）

细胞周期蛋白的降解盒与降解途径

部分哺乳动物（A）和酵母细胞（B牙殖和C裂殖）周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK活性的关系（图14-5）

四、CDK和CDK抑制因子 周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase, CDK）：由周期蛋白结合并活化的调控细胞周期进程的蛋白激酶。 CDK通过磷酸化其底物而对细胞周期进行调控。 CDK有多种：在人体中发现并命名的CDK包括CDK1（Cdc2）~CDK13。不同的CDK在细胞周期中起调节作用的时期不同。 某些CDK与cyclin的配对关系及执行的功能的时期：见表14-1。 CDK激酶结构域：各种CDK的CDK激酶结构域保守程度有所不同，但其中有一小段序列则相当保守，即PSTAIRE序列，与周期蛋白结合有关。 CDK的活性受磷酸化修饰调节：细胞内存在多种因子，对CDK分子结构进行磷酸化修饰，从而调节CDK的活性。 CDK抑制蛋白（CDK inhibitor, CKI）：指对CDK起负调控作用的蛋白质，包括Cip/Kip家族和INK家族。① Cip/Kip家族：包括p21、p27和p57等，其中p21主要对G1期CDK（CDK2~4和CDK6）起抑制作用 p21还与DNA聚合酶δ的辅助因子增殖细胞核抗原（PCNA）结合，抑制DNA的复制；② INK家族：包括p16、p15、p18和p19等，其中p16主要抑制CDK4和CDK6活性。

通过PCR技术测定与CDK1类似的CDK蛋白分子图解（图14-6）

不同类型的周期蛋白 G2/M-CDK 激酶复合体 脊椎动物 芽殖酵母 Cyclin CDK G1-CDK Cyclin D* Cln 3 CDK1(CDC28) G1/S-CDK Cyclin E CDK2 Cln 1、2 S-CDK Cyclin A Clb 5、6 G2/M-CDK Cyclin B CDK1(CDC2) Clb 1-4

周期蛋白-周期蛋白依赖型激酶复合物在真核生物细胞周期调控中的作用 周期蛋白-周期蛋白依赖型激酶复合物在细胞周期调控中的作用 G1 G1-S S G2-M 芽殖酵母 Cln3- CDC28 Cln1/2- CDC28 Clb5/6- CDC28 Clb1-4 -CDC28 裂殖酵母 Cig1- CDC2 Cig2- CDC2 Cdc13- CDC2 脊椎动物 CycD- CDK4/6 CycE- CDK2 CycA- CDK2 CycA/B- CDK1 植物 CycD- CDKA CycA- CDKA CycA/B- CDKA CDC: 细胞分裂周期蛋白

Cyclin的周期性变化

植物细胞周期控制的图示

p21抑制作用的机理

五、细胞周期运转调控 细胞周期调控系统（cell cycle control system）是指调节细胞周期运行的蛋白质网络系统。 CDK因对细胞周期运行起着核心调控作用而被称为周期引擎分子。不同种类的周期蛋白与不同种类的CDK结合，构成不同的MPF。不同的MPF在细胞周期的不同时期表现活性，因而对细胞周期的不同时期进行调节。MPF又被称作细胞周期引擎。 （一）G2/M期转化与CDK1的关键性调控作用 （二）M期周期蛋白与细胞分裂中期向后期转化 （三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK （四）S/G2/M期转换与DNA复制检查点

（一）G2/M期转化与CDK1的关键性调控作用 CDK1活性依赖于cyclinB含量的积累： cyclinB（或cyclinA）的含量达到一定值并与CDK1结合，同时在其它一些因素的调节下，逐渐表现出最高激酶活性（G2/M期转换和M期启动）。 CDK1催化底物蛋白磷酸化：CDK1通过使某些底物蛋白磷酸化，改变其下游的某些靶蛋白的结构和启动其功能，实现其调控细胞周期的作用。CDK1选择底物中某个特定序列中的某个Ser/Thr残基磷酸化。CDK1可以使多种底物蛋白磷酸化（见表14-2）。 CDK活性受到多种因素的综合调节：①周期蛋白与CDK结合只是激活CDK活性的先决条件：仅周期蛋白与CDK结合，并不能使CDK激活；②还需要其它几个步骤的修饰：cyclinB-CDK1复合物（无活性）→ Wee1/mik1激酶和CDK1活化激酶（CAK）→ cyclinB-CDK1的Thr14、Tyr15和Thr161磷酸化（无活性前体MPF） →cdc25C蛋白磷酸酶→ cyclinB-CDK1仅剩Thr161磷酸化（有激酶活性的MPF ）（ MPF 对cdc25C 有正反馈作用） 不同的CDK之间有一定的代偿功能；CDK对个体和器官的发育也起着重要的调节作用。

cyclin B在CDK1活性调节过程中的作用（图14-7）

CDK1激酶活性综合控制示意图（图14-8）

活性MPF的正反馈

（二）M期周期蛋白与细胞分裂中期向后期转化 后期促进复合物（anaphase-promoting complex，APC）：20S，泛素连接酶（E3），通过泛素依赖性蛋白降解途径，降解M期周期蛋白和中期向后期转换的非周期蛋白类负调控因子，使细胞从中期向后期转换。 APC至少由15种成分组成，分别称为APC1~APC15。APC的发现是细胞周期研究领域中又一重大进展，表明细胞分裂中期向后期转换也受到精密调控。 APC的主要作用：到达分裂中期后，cyclinB/A与CDK1分离，在APC介导下，通过泛素化依赖途径而降解。CDK1活性消失，细胞由分裂中期向后期转化。 APC活性受到多种因素的综合调节：① M期CDK激酶和蛋白磷酸酶对APC的活性起着调节作用；② 纺锤体组装检查点调控APC的活性，如cdc20和Mad2（有丝分裂捕获缺陷蛋白2）分别为APC有效的正调控因子和负调控因子，在分裂中期之前，位于动粒上的Mad2与cdc20结合并抑制其活性。到分裂中期，Mad2从动粒上消失，解除对cdc20的抑制作用，促使APC活化，导致M期周期蛋白降解，M期CDK活性丧失。

后期促进复合物（ APC ）作为有丝分裂的终结者

马达蛋白和微管系统共同协作导致染色体分离

Cyclin B的降解途径

（三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK 细胞由G1期向S期（G1/S期）转化主要受G1期周期蛋白依赖性CDK：cyclinD-CDK4/6、cyclinE- CDK2和cyclinA-CDK2。 cyclinD-CDK4/6为细胞G1/S期转化所必需：cyclinD包括D1、D2和D3，它们的表达有细胞和组织特异性；cyclinD-CDK4/6的底物主要是Rb蛋白（retinoblastoma protein）即成视网膜细胞瘤蛋白，Rb蛋白是E2F的抑制因子，E2F是促进与G1/S期转化和DNA复制有关的基因转录的转录因子，Rb蛋白在G1/S期转化中起负调控（“刹车”）作用，在G1期的晚期通过磷酸化而失活。 cyclinE-CDK2为S期启动所必需：cyclinE-CDK2的主要作用是去除p107（类Rb蛋白）对E2F的抑制作用，促进G1/S期转化；cyclinE-CDK2是TGF-β的主要靶酶，TGF-β可以有效地抑制cyclinE-CDK2活性，进而将细胞阻止在G1期；cyclinE在肿瘤细胞中的含量比正常细胞中要高得多；在细胞中，提高cyclinE的表达，该细胞则快速进入S期，而且对生长因子的依赖性降低。 cyclinA-CDK2也可以作用于p107（类Rb蛋白）：除此之外，cyclinA合成虽始于G1/S期转化时期，但cyclinA-CDK2却是S期主要的CDK。

Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F

p53和Rb在细胞周期调节中的作用

G1期周期蛋白是到达S期的一定阶段通过SCF泛素化途径降解的，同时需要G1期CDK的参与：SCF （Skp-cullin-F-box protein）（间期初级活化因子）是一种具有泛素连接酶（E3）功能的多亚基的蛋白复合物（Skp1、Cul1和Rbx1），可以被Skp2、β-Trcp或Fbw7三种F-box蛋白分别活化，而且SCF的底物特异性的识别是由F-box蛋白来决定的；SCF通过降解细胞周期的不同时期的不同的底物从而在整个细胞周期中都发挥作用（但主要在细胞间期G1、S和G2期发挥作用），如降解① G1期周期蛋白（cyclinA、D1和E）（PEST序列对降解起促进作用），② CKI（p21、p27和p57），③ DNA复制调控因子（ORC1和Cdt1）和 ④其它（cdc25a、Wee1和Emi1）。 APC主要在M期和G1期早期发挥作用：APC的2个负责底物识别的因子是cdc20和Cdh1，APC催化的底物见图14-9。

间期初级活化因子（ SCF ）和后期促进复合物（ APC ）在细胞周期中的活动

APC和SCF在细胞周期中的活性及其底物（图14-9）

SCF泛素化依赖蛋白质降解途径（图14-10）

其它对DNA复制起始活动进行综合调控的因素： DNA复制的起始并不仅仅是在G1期末的起始点（限制点）处才决定的。早在G1期开始时，许多与DNA复制有关的物质即已表达并与染色质结合，开始了DNA复制的起始调控。 ①ORC（复制起始点识别复合物）： ORC识别DNA复制起始点并与之结合，这是DNA复制起始所必需的；②cdc6和cdc45也是DNA复制所必需的调控因子：cdc6在G1期早期与染色质结合，到S期早期从染色质上解离下来；cdc45约在G1期晚期才与染色质结合，CDK6对cdc45 于染色质的结合起促进作用；③DNA复制执照（licensing）因子—Mcm蛋白（minichromosome mantenance protein）：在M期，胞质中的执照因子Mcm蛋白（DNA解旋酶）与染色质接触并与之结合，使染色质获得DNA复制所必需的“执照”，但随着DNA复制进程“执照”信号会不断减弱直到消失，只有等到下一个M期重新获得“执照”，才能开始新一轮的DNA复制。 DNA复制起始调控是近十年细胞周期调控研究中的又一大进展。

ORC、cdc6、cdc45、CDK和Mcm与染色质的结合及其在DNA复制起始调控中的作用（图14-11）

（四）S/G2/M期转换与DNA复制检验点 检查点（checkpoint）：细胞周期的调控点，检验细胞从一个周期时相进入下一个时相的条件是否适合。除CDK及其直接的活性调节因子外，还有不少其他因素参与细胞周期调控过程，如各种检查点等。各种检查点也有专门的调控机制。 DNA复制检查点主要包括2种：① S期内部检查点（intra-S phase checkpoint）：指在S期内发生DNA损伤（如双链断裂）时，S期内部检查点被激活，从而抑制复制起始点的启动使DNA复制速度减慢，S期延长，同时激活DNA修复和复制叉的恢复等机制。② DNA复制检查点（DNA replication checkpoint）：指由于停滞的复制叉导致的S期的延长。这2种检查点能够将细胞停滞在S期和G2/M期。当DNA复制叉阻断引发单链DNA时，ATR-CHK1通路被激活；当DNA双链断裂时，ATM-CHK2通路被激活。ATR/ATM是DNA损伤信号感受因子，也是与PI-3-K同源的激酶，激活下游信号通路。CHK即检查点激酶。

四个主要的检验点

S/G2/M期转化与DNA复制检查点（图14-12）

DNA损伤检查站的作用机理模型

六、其他因素在细胞周期调控中的作用 癌基因和抑癌基因产物对细胞增殖和分化起着重要的调控作用：① 癌基因产物大致可归纳为多肽类生长因子、膜表面生长因子受体和激素受体、类固醇和甲状腺素受体、信号转导器、蛋白激酶、转录因子和核蛋白等几个类型。它们在细胞周期信号调控中各自起着不同的作用。②抑癌基因产物对细胞增殖起负调控作用，如Rb和p53等。p53常被称为“分子警察”，抑制CDK1、CDK2和CDK4等的活性，从而影响细胞周期运转。 除细胞内在因素外，细胞和机体的外在因素对细胞周期也有重要影响：如病毒感染、化学物质作用、离子辐射、温度变化和pH变化等。

第二节 癌细胞 一、癌细胞的基本特征 二、癌基因与抑癌基因 三、肿瘤的发生是基因突变逐渐积累的结果 四、肿瘤干细胞

一、癌细胞的基本特征 动物体内因细胞分裂调节失控而无限增殖的细胞称为肿瘤细胞（tumor cell）。具有转移能力的肿瘤称为恶性肿瘤（malignancy），源于上皮组织的恶性肿瘤称为癌（cancer）。目前癌细胞已作为恶性肿瘤细胞的通用名称。其主要特征如下： （1）细胞生长、分裂和分化失去控制：细胞核-质比例增大，分裂速度加快，成为“不死”的永生细胞。癌细胞在分化程度上低于正常细胞和良性肿瘤细胞。 （2）具有侵润性和扩散性：良性肿瘤（benign tumor）如疣和息肉的细胞，虽不受正常生长调控，但不具有侵润性和扩散性。癌细胞的细胞黏着性下降，具有侵润性和扩散性。由转移并在身体其它部位增殖产生的次级肿瘤称为转移灶（metastasis）。 （3）细胞间相互作用改变：癌细胞既冲破了细胞识别作用的束缚，又逃脱了免疫系统的监控。 （4）表达谱或蛋白质活性改变：癌细胞的种种生物学特征主要归结于基因表达及调控方式的改变。癌细胞常常出现一些在胚胎细胞中所表达的蛋白质；多数癌细胞中具有较高的端粒酶活性；癌细胞还经常异常表达或过量表达一些蛋白质或酶。癌细胞具有表型不稳定性，即癌细胞具有异质性特征。 （5）体外培养的恶性转化细胞的特征： （人工诱导培养的）恶性转化细胞同癌细胞一样具有无限增殖的潜能，在体外培养时贴壁性下降，失去分裂和运动的接触抑制，在软琼脂培养中可形成细胞克隆。

癌细胞的扩散（图14-13）

肿瘤细胞失去接触抑制现象

二、癌基因与抑癌基因 癌症主要是体细胞多个基因位点累积突变引起的疾病。 癌基因（oncogene）：即控制细胞生长和分裂的一类正常基因，其突变能引起正常细胞转变成癌细胞。癌基因起源于细胞，并普遍存在于许多生物基因组中。癌基因编码的蛋白质主要包括生长因子、生长因子受体、信号转导通路中的分子、基因转录调控因子、细胞周期调控蛋白、DNA修复相关蛋白和细胞凋亡蛋白等7大类型。细胞信号转导是细胞增殖与分化过程的基本调控方式，而信号转导通路中蛋白因子的突变是细胞癌变的主要原因。 癌基因可以分成2大类：① 病毒癌基因：指反转录病毒的基因组中带有可使受病毒感染的宿主细胞发生癌变的基因，简写成v-onc；②细胞癌基因：又称原癌基因（protooncogene），指在正常细胞基因组中对细胞正常生命活动起主要调控作用的正常基因，其功能获得性突变（组成型激活或过量表达或不能在适当的时刻关闭表达）能引起细胞癌变，简写成c-onc。研究发现，许多致癌病毒中的癌基因与正常细胞中的某些DNA序列高度同源，从而推测病毒癌基因起源于细胞的原癌基因。 抗癌基因（antioncogene）或抑癌基因或肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）：该类基因编码的蛋白质可以抑制细胞生长并防止细胞癌变，其功能丢失性突变将导致细胞癌变。抑癌基因或其编码的蛋白质的主要功能可概括为3类：①偶联细胞周期与DNA损伤；②起始凋亡程序；③转移抑制者。抑癌基因编码的蛋白质实际上是正常细胞增殖过程中的负调控因子，在细胞周期的检验点上起阻止细胞周期进程的作用，或者是促进细胞凋亡，或者既抑制细胞周期调节，又促进细胞凋亡。 p53基因（p53 gene）：于1979年发现的第一个抑癌基因，编码一种基因调控蛋白（ p53 ），当DNA受到损伤后被活化，阻止细胞周期运转或者介导细胞凋亡。 抑癌基因与癌基因之间的区别在于：癌基因的突变性质是显性的，抑癌基因的突变性质是隐性的。

一些原癌基因的功能 原癌基因 功能 相关肿瘤 sis 生长因子 Erwing网瘤 erb-B RTK，EGF受体 星形细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、 肺癌、胃癌、唾腺癌 fms RTK，CSF-1 受体 髓性白血病 ras G-蛋白 肺癌、结肠癌、膀胱癌、直肠癌 src 非RTK 罗氏肉瘤 Abl-1 非RTK 　 慢性髓性白血病 raf MAPKKK　 腮腺肿瘤 vav 信号转导连接蛋白 白血病 myc 转录因子 Burkitt 淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病 myb 结肠癌 fos 骨肉瘤 jun erb-A 急性非淋巴细胞白血病 bcl-1 cyclinD1 B细胞淋巴瘤

控制细胞生长和增殖，并与肿瘤发生相关的7类蛋白（图14-14）

基因从寄主细胞转移到病毒基因组

能把原癌基因转成致癌基因的遗传变化

原癌基因激活的可能途径

一些抑癌基因的功能 抑癌基因 功能 相关肿瘤 Rb 转录因子 RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、 结肠癌 P53 WT 负调控转录因子 WT、横纹肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母细胞瘤 NF-1 GAP，ras 激活因子 神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、雪旺氏细胞瘤、神经纤维瘤 DCC 细胞粘附分子 直肠癌 P21 CDK抑制因子 前列腺癌 P15 CDK4、CDK6抑制因子　 成胶质细胞瘤 BRCA1 DNA修复因子，与RAD51作用 乳腺癌、卵巢癌 BRCA2 乳腺癌、胰腺癌 PTEN 磷酯酶

抑癌基因充当细胞的刹车

Rb基因的作用

p53 与细胞DNA损伤（图14-15）

细胞信号调控网络及肿瘤发生相关的主要调控因子（图14-16）

三、肿瘤的发生是基因突变逐渐积累的结果 根据基因的自然突变率、人一生中细胞分裂的次数（1016）和生活环境中的致癌因素（如辐射、化学诱变剂和肿瘤病毒感染）综合考虑，肿瘤的发生频率应该很高，但实际上却非常之低，这是为什么？ 癌症是一种典型的老年性疾病：因为癌症涉及一系列的原癌基因与抑癌基因的致癌突变的逐渐积累（至少5~6个）（见图14-17）。生殖细胞中发生致癌突变，细胞癌变发生所需的基因突变数的积累时间就会缩短，携带这种基因突变的家族成员更易患癌症；白血病等血细胞的恶性增生，因不涉及侵润这一环节，而直接随血液流遍全身，故只要少数基因突变，便可导致癌症发生，患病年龄也相应提早。 抑癌基因的突变性质是隐性的：即只有当2个拷贝都发生突变时，细胞才会癌变。细胞如果含有1个正常的抑癌基因和1个突变的等位基因，一般是正常的。细胞分裂过程中，如果出现纺锤体结构的缺陷，导致染色体的错误分离（见图14-18中A），或者带有野生型和突变型的染色体之间发生重组（见图14-18中B），就可能形成抑癌基因的1对等位基因都突变的细胞。癌基因的突变性质是显性的：即2个拷贝中只要有1个拷贝突变就会激活癌基因，导致细胞癌变。

一系列相关基因突变导致结肠癌发生（图14-17） APC（adenomatosis polyposis coli）：结肠腺瘤息肉 DCC（deleted in colorectal cancer）：缺失性结直肠癌

抑癌基因的隐性作用

造成突变纯合体的2种机制（图14-18）

四、肿瘤干细胞 值得关注的现象：癌组织中各细胞的致癌能力及对化学药物的抗性是有很大差别的。 肿瘤干细胞（cancer stem cell）：指存在于某些肿瘤组织中的一群干细胞样细胞。 与正常干细胞相比：肿瘤干细胞也具有无限增殖、转移和抗（排除）化学毒物损伤的能力，而且二者使用一些共同的信号通路，但肿瘤干细胞增殖失控，失去正常分化能力，转移到多种组织后形成异质性的肿瘤，破坏正常组织与器官的功能。 与一般肿瘤细胞相比：肿瘤干细胞具有高致瘤性而且耐药性强（表达了ABC家族膜转运蛋白）。 肿瘤化疗失败的主要原因：目前认为肿瘤干细胞的存在是导致肿瘤化疗失败的主要原因。 肿瘤干细胞起源于成体干细胞：在致癌因子的诱导下，干细胞、周期中细胞和终末分化细胞可能转化为肿瘤干细胞，最终能够增生为肿瘤；当然它们的部分也会发生异质化而失去致癌性。

肿瘤干细胞与肿瘤的发生机制模型（图14-19）

本章概要（一） 细胞周期运转受到细胞内外各种因素的精密调控，细胞内因是调控依据。研究发现，周期蛋白依赖性CDK是细胞周期调控中的重要因素。目前已发现，在哺乳动物细胞内至少存在13种CDK，即CDK1至CDK13。一般情况下，CDK至少含有两个亚单位，即周期蛋白和CDK蛋白。周期蛋白为其调节亚单位，CDK蛋白为其催化亚单位。周期蛋白也有多种，在哺乳动物细胞中包括周期蛋白A、B、C、D、E、F、G、H、L、T等，分别与不同的CDK蛋白结合。不同的CDK在细胞周期中起调节作用的时期不同。CDK通过磷酸化其底物而对细胞周期进行调控。CDK活性也受到其他因素的直接调节。除CDK及其直接的活性调节因子外，还有不少其他因素参与细胞周期调控过程，如各种检验点等。各种检验点也有专门的调控机制。所有这些因素，可能组成一个综合的调控网络。 DNA复制起始调控是近十年细胞周期调控研究中的又一大进展。DNA复制的起始并不仅仅是在G1期末的起始点（限制点）处才决定的。早在G1期开始时，许多与DNA复制有关的物质即已表达并与染色质结合，开始了DNA复制的起始调控。目前已经知道，Orc、cdc6、cdc45、Mcm等蛋白质参与了DNA复制的起始调控过程。这一调控过程也需要某些CDK激酶参与，尤其是周期蛋白E-CDK2。

本章概要（二） 分裂后期促进因子APC的发现是细胞周期研究领域中又一重大进展。到达分裂中期后，周期蛋白B/A与CDK1分离，在APC介导下，通过泛素化依赖途径而降解。CDK1活性消失，细胞由分裂中期向后期转化。APC的成分至少含有8种，分别称为APC1至APC8。APC活性也受到多种因素的综合调控，其中cdc20为APC有效的正调控因子。在分裂中期之前，位于动粒上的Mad2可以与cdc20结合并抑制后者的活性。到分裂中期，Mad2从动粒上消失，解除对cdc20的抑制作用，促使APC活化。 细胞增殖调控紊乱，可能导致细胞癌变。细胞癌变即可以看做是正常细胞增殖失控，也可以看做是细胞分化失控。癌基因是控制细胞生长和分裂的正常基因（又称原癌基因）的一种突变形式，能引起正常细胞癌变。癌基因编码的蛋白质主要包括生长因子、生长因子受体、信号转导通路中的分子、基因转录调控因子和细胞周期调控蛋白等几大类型。抑癌基因实际上是正常细胞增殖过程中的负调控因子，它编码的蛋白质往往在细胞周期的检验点上起阻止细胞周期进程的作用。如果抑癌基因突变，丧失其细胞增殖的负调控作用，则导致细胞失控而过度增殖。癌症是一种典型的老年性疾病，它涉及一系列的原癌基因与抑癌基因的致癌突变的积累。癌症的发生与肿瘤干细胞有密切关系。

第十五章 细胞分化与胚胎发育 第一节 细胞分化 第二节 胚胎发育中的细胞分化

第一节 细胞分化 一、细胞分化的基本概念 二、细胞的全能性与多能干细胞 三、影响细胞分化的因素

几种生物的细胞数目与类型（表15-1）

分子杂交技术检测基因及其mRNA的表达（表15-2）

组合调控的作用机制示意图（图15-1）

黏菌繁殖过程示意图（图15-2）

造血干细胞逐级分化为各种类型的血细胞（图15-3）

诱导多能干细胞（ iPS ）建系过程的示意图（图15-4）

人胚胎干细胞建系的示意图（图15-5）

人类治疗性克隆与再生医学的设想（图15-6）

人的胚胎干细胞诱导分化成胰岛β细胞（图15-7）

与人胚胎干细胞的维持相关的主要信号分子及信号通路示意图（图15-8）

细胞分化与3个胚层发生的分子机制的示意图（图15-9）

第二节 胚胎发育中的细胞分化 一、生殖细胞的分化 二、早期胚胎发育过程中的细胞分化 三、果蝇胚胎早期发育中的细胞分化

原生殖细胞（PGC）的迁移（图15-10）

性腺细胞分化中的信号途径（图15-11）

PGC进入生殖嵴后的细胞分裂（图15-12）

生殖嵴对生殖细胞减数分裂的调控（图15-13）

神经管的形成（图15-14）

调控脊髓神经细胞增殖的信号系统（图15-15）

神经元前体细胞通过侧向抑制而特化（图15-16）

脊髓背腹分化中的信号网络（图15-17）

（图15-果蝇体节形成中的基因调控）

本章概要（一） 在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类型的过程称之为细胞分化。细胞分化是基因选择性表达的结果。分化细胞所表达的基因一类称管家基因，另一类称组织特异性基因。组织特异性基因的产物不仅影响分化细胞的形态结构，而且决定细胞所执行的各自的生理功能。每种类型的分化细胞是由不同的调控蛋白以组合调控的方式，启动组织特异性基因的表达，从而实现细胞分化的调控。细胞分化程序与调控涉及诸多因素，如受精卵的不均一性、胞外信号分子的作用、细胞间的相互作用与细胞的位置效应以及细胞的记忆等。其中，信号分子的作用是调控细胞分化最主要的因素。 干细胞是机体中能进行自我更新和多向分化潜能并具有形成克隆能力的一类细胞。根据分化潜能的不同，干细胞可分为全能干细胞、多潜能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。根据来源不同，干细胞又可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。诱导性多潜能干细胞制备技术的建立，不仅加深了人们对细胞全能性的理解，而且极大地推动了干细胞与细胞分化的理论研究及其临床应用。 细胞分化最伟大的杰作，在于后生生物个体的形成，而后生动物的发育，是最为复杂，也是最引人入胜的生命过程。生物相对有限的基因，凭借重复而富有创造性的方式指导细胞的行为，分化并产生当今世界上多种生命体。在这个过程中，FGF、TGF-β、RA、Shh和Wnt等信号系统，按照极其相似的方式调控各种发育进程。

本章概要（二） 哺乳动物雌雄两性的分化，源于生殖腺细胞的分化。性腺原基——生殖嵴的固有分化方向是卵巢，Y染色体携带的SRY基因对性腺分化为睾丸是必需的，而Sox9则是更普遍的决定睾丸分化的基因，存在于所有脊椎动物。原生殖细胞经过长距离迁移，进入生殖嵴，它们的分化方向由性腺的分化方向决定，RA和Wnt信号通路起了决定作用，尤其是RA及其颉颃物Cyp26b1是控制减数分裂的关键因素。 脊椎动物的发育过程经过受精、卵裂、囊胚和原肠胚，形成3个胚层，脊索中胚层诱导其附近的外胚层形成神经管。神经管的形成，是微管和微丝等细胞骨架联合作用的结果。神经管形成后，一部分细胞逐渐停止分裂并迁移到外侧，神经管上皮细胞则保持分裂能力。这个过程依靠FGF、RA、Wnt、Shh和BMP信号途径的相互协调，以及神经前体细胞依靠Delta－Notch信号而形成的旁侧抑制作用。神经管细胞的背腹分化，则主要依赖于背部的BMP信号分子浓度梯度和腹侧Shh浓度梯度，而体节中胚层分泌的RA信号分子与Shh相互颉颃，对神经管中部神经元的分化至关重要。 脊椎动物胚胎发育过程中，细胞的分化命运大部分由其所处环境决定，细胞附近的组织对细胞分化发挥了巨大作用，这就是调整型发育。大部分无脊椎动物的发育则与此不同，其细胞分化命运大部分是由细胞本身所决定的，对细胞所处环境依赖较小，这称为镶嵌型发育。果蝇的发育就是典型的镶嵌型发育，母体效应基因决定了胚胎前后轴和背腹轴，并通过级联反应调控体节的形成。 随着对发育机制的深入了解，不同组织的发育进程逐渐显示出越来越多的内在共性，人们越来越了解有限的基因如何“演奏”出精彩无限的细胞分化的绚丽“乐章” 。

第十六章 细胞死亡与细胞衰老 对于多细胞生物，细胞的死亡是维持整个生物体的正常生长发育及生命活动的必要条件，其重要性不亚于细胞的增殖。细胞死亡的方式多种多样，包括细胞凋亡（apoptosis）、细胞坏死（necrosis）和自噬性细胞死亡（autophagic cell death）。 细胞衰老（cell ageing，cell senescence）主要指复制衰老，是体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止生长，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。 第一节 细胞死亡 第二节 细胞衰老

第一节 细胞死亡 程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）：是指受到严格的基因调控的程序性的细胞死亡形式。细胞死亡往往受到细胞内某种由遗传机制决定的“死亡程序”控制，所以被称为细胞程序性死亡。动物细胞典型的程序性死亡方式包括凋亡、坏死和自噬性细胞死亡。细胞程序性死亡对生物体的正常发育、自稳态平衡及多种病理过程具有重要的意义。 一、细胞凋亡 二、细胞坏死 三、自噬性细胞死亡 四、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡

一、细胞凋亡 细胞凋亡（apoptosis）：是借用古希腊语，意指树叶或花瓣的凋零脱落。细胞凋亡是一个由基因决定的主动的生理性自杀行为，即细胞接受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应。细胞凋亡具有典型的形态学和生化特征，凋亡细胞最后以凋亡小体被吞噬消化。 （一）细胞凋亡的特征 （二）细胞凋亡的检测方法 （三）细胞凋亡的生物学及医学意义 （四）细胞凋亡的分子机制

（一）细胞凋亡的特征 动物细胞凋亡的过程在形态学上可分为3个阶段：① 凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整；核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。② 凋亡小体的形成：凋亡小体（apoptotic body）是细胞凋亡过程中断裂的大小不等的DNA或染色质片段与细胞其它内含物一起被反折的细胞质膜包裹，在细胞表面产生许多泡状或芽状突起，然后逐渐分离，形成的单个圆形小体。③ 凋亡小体的被吞噬：凋亡小体逐渐被邻近的细胞识别并吞噬消化。 细胞凋亡的特征：最重要的特征是凋亡过程中细胞膜保持完整，细胞内含物没有泄漏到细胞外，不引发机体的炎症反应。这也是细胞凋亡与坏死的主要区别。另一个重要特征是染色质DNA在核小体间发生断裂，形成长度为200bp倍数的大小不等DNA片段。此外，凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。

细胞凋亡的过程及特征（图16-1）

正常胸腺细胞（左）与凋亡胸腺细胞（右）比较（注意凋亡小体）

（二）细胞凋亡的检测方法 1. 形态学观察：染色法（图16-2）、透射和扫描电镜观察。 2. DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带（DNA ladder），即凋亡细胞的DNA由于在核小体间发生断裂，产生200bp及其整倍数的片段，经琼脂糖凝胶电泳呈现出的梯状条带（图16-3）。 3. DNA断裂的原位末端标记法（TUNEL法）：即末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法，能对DNA分子中断裂缺口中的3’-OH进行原位标记（图16-4）。 4.彗星电泳法（comet assay）：彗星电泳法的原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再进行短时间的电泳，并用荧光染料染色。凋亡细胞中的DNA降解片段在电泳时迁移较快，使细胞核呈现出一种彗星式图案，而正常细胞核则保持圆球形。 5. 流式细胞分析：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失（亚二倍体），采用碘化丙锭染色使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞。

凋亡细胞的染色质凝集（图16-2） A：正常细胞核 B：凋亡细胞核

凋亡细胞的典型特征：DNA梯状条带（图16-3）

原位末端标记法显示斑马鱼胚胎发育过程中的细胞凋亡（图16-4） 左：正常16体节期的斑马鱼胚胎在发育过程中有少量细胞发生凋亡；右：突变体的中枢神经细胞发生大量凋亡

（三）细胞凋亡的生物学及医学意义 细胞凋亡的意义：细胞凋亡对生物体的正常发育、自稳态平衡、免疫耐受的形成、肿瘤监控以及抵御内外各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用：如脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的成形过程，蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡。 细胞凋亡的失调，包括不恰当的凋亡的激活或抑制以及过度凋亡等，都会引发多种疾病。

细胞凋亡使得神经细胞与靶细胞的数量相匹配（图16-5）

细胞凋亡与手和足的成形

蝌蚪尾的消失

（四）细胞凋亡的分子机制 诱导细胞凋亡的因子大致可分为2大类：① 物理性因子：包括射线（紫外线，γ射线等）、较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。② 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子、Ca2+载体、激素、细胞生长因子、DNA和蛋白质合成的抑制剂、细胞毒素和肿瘤坏死因子α（TNFα）等。 细胞凋亡的途径主要包括2条：① Caspase (cysteine aspartic acid specific protease)（）依赖性细胞凋亡途径；② 非Caspase依赖性细胞凋亡途径。当细胞受到凋亡信号的刺激时，这2条途径一般能够同时被激活。 细胞凋亡的途径包括4个小阶段：① 接收凋亡信号→ ② 凋亡相关分子的活化→ ③ 凋亡的执行→ ④ 凋亡细胞的清除

1. Caspases（凋亡蛋白酶）：Caspases是cysteine aspartic acid specific proteases的缩写，意指天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，是一组存在于细胞质中的与细胞凋亡有关的结构类似的蛋白酶家族，其活性位点包含半胱氨酸（Cys / C），能选择性裂解靶蛋白中天冬氨酸（Asp）残基后的肽键，使靶蛋白活化或失活。 Caspase-1（凋亡蛋白酶1）：即白介素-1β转换酶（ICE, interleukin-1β converting enzyme），是哺乳动物细胞中与线虫Ced3同源的蛋白酶，催化白介素-1β前体的剪切成熟过程。Ced3和Ced4是秀丽隐杆线虫发育过程中细胞凋亡必需的蛋白酶，Ced9的功能是抑制细胞凋亡。目前发现的凋亡蛋白酶（caspase）有15种。其中caspase-1、-4和-5主要负责白介素-1β前体的活化，不直接参与凋亡信号的传递；其余的caspase都参与细胞凋亡过程。 参与细胞凋亡caspases主要分为2大类：① 凋亡起始者（apoptotic initiator）：caspase-2、-8、-9、-10和-11，负责对效应者caspases的前体进行切割（激活）； ② 凋亡效应者（apoptotic executioner）：caspase-3、-6和-7，负责切割细胞质内、细胞核内的结构蛋白和调节蛋白，使其失活或活化，保证凋亡程序的正常进行。

caspases家族成员及其在细胞凋亡过程中的功能（表16-1）

Caspases酶原的活化 Caspase自身通常以非活化的caspase酶原（procaspase）形式存在存在于细胞质基质中，在接受凋亡刺激后，caspase酶原分子在特异的天冬氨酸残基位点被切割，产生的2段多肽形成大小2个亚基，再聚合成异二聚体，此即为具有活性的caspase。 起始者caspases的同性活化（homo-activation）：即同一种caspases酶原分子彼此结合或与接头蛋白（adaptor）结合形成复合物，此间构象改变被活化，进而彼此切割产生有2个活性的二聚体形式。在起始者caspase中，caspase-2和-9含有caspase募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)/ 死亡结构域（death domain，DD），而caspase-8和-10含有串联重复的死亡效应结构域（death effector domain，DED）。这2种结构域存在于caspase酶原分子和一些凋亡相关的接头蛋白分子中，通过结构域之间的聚合，caspases能够彼此结合或与接头蛋白结合，被招募到上游信号复合物中而发生同性活化。 效应者caspases的异性活化（hetero- activation）：即已活化的起始者caspases招募效应者caspases酶原分子后，对其进行切割，产生具有活性的效应者caspases。活化的效应者caspases切割细胞中重要的结构蛋白（如细胞支架蛋白）和调节蛋白（如信号蛋白、转录因子和周期蛋白等），导致细胞凋亡。 Caspases酶原的活化具有级联放大效应。

Caspases酶原的活化（A）和caspases级联反应（B）（图16-6）

效应者caspases底物：约280种，可分为活化和失活2大类。 被效应者caspase活化的代表底物—Caspase激活的DNA酶（Caspase activated DNase，CAD）：通常状况下，CAD与其抑制因子ICAD（inhibitor of CAD）结合在一起，处于失活状态。细胞凋亡程序启动后，活化的效应者Caspase-3降解ICAD，使CAD释放出来并在核小体间切割DNA，形成间隔200bp或其整倍数的DNA片段，琼脂糖电泳时产生凋亡标志性特征的梯状条带。 被效应者caspase失活的代表底物：众多被效应者caspase失活的代表底物都在维护细胞正常状态中发挥关键作用，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、黏着斑激酶（FAK）和核纤层蛋白等。

效应者Caspases作用的底物举例 类型 代表性蛋白 作用 核酸内切酶 Caspase活化的DNA酶（CAD） 抑制蛋白（ICAD）被切割后激活，导致核内DNA降解，形成DNA梯 DNA修复的酶 多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP） PARP被切割后失活，丧失修复活性，以便DNA降解 蛋白激酶 黏着斑激酶（FAK）、PKB、PKC和RAF1 FAK失活破坏细胞黏着，导致凋亡细胞皱缩而与邻近细胞脱离，便于细胞吞噬 细胞支架蛋白 核纤层蛋白、中间丝、肌动蛋白和凝溶胶蛋白 被切割后导致核纤层解体，细胞核收缩，细胞形态改变 值得注意的是：由于Caspase在细胞凋亡途径中发挥关键作用，所以可将其作为靶标分子来设计药物。

2. Caspases依赖性细胞凋亡途径：主要包括由死亡受体起始的外源途径和由线粒体起始的内源途径。同时，细胞内还存在不依赖于caspases的凋亡途径。 （1）依赖于caspases的由死亡受体起始/介导的外源细胞凋亡途径：当凋亡配体（如FasL或TNF等）与细胞表面死亡受体（如Fas或TNF-R1）结合后，引起死亡受体聚合，聚合的死亡受体通过其胞质区的死亡结构域（DD）招募接头蛋白（FADD或TRADD和FADD）结合，接头蛋白再通过其死亡效应结构域（DED）招募起始者caspases酶原（如caspases-8酶原），形成死亡诱导信号复合物（death inducing signaling complex，DISC）。起始者caspases酶原（如caspases-8酶原）在DISC中通过同性活化而被激活，进而通过异性活化效应者caspases（如caspases-3）（或信号分子Bid），作用于关键的结构蛋白和调节蛋白等底物，导致细胞凋亡。

死亡配体—肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）：即由激活的单核－巨噬细胞分泌的能够诱导细胞凋亡和诱发炎症反应的死亡信号分子，其本身属于细胞因子。FasL即Fas的配体，也是诱导凋亡的死亡配体。 死亡受体：死亡配体的生物学功能是通过与细胞表面的死亡受体结合来实现的。人类细胞中至少有8种死亡受体：TNF-R1（肿瘤坏死因子受体-1）、Fas（Apo-1/CD95）、DR-3（Apo-3/WSL-1/TRAMP）、DR-4（TRAIL-R1）、DR-5（TRAIL-R2）、DR-6、EDA-R（外胚层发育异常受体）和NGF-R（神经生长因子受体）。死亡受体的胞外部分为配体结合结构域，胞内部分为死亡结构域（DD），负责招募凋亡信号通路中的细胞内信号分子。 接头蛋白（adaptor） ：接头蛋白在活化受体和起始者caspases酶原之间起中介作用，常常既具有死亡结构域（DD），又具有死亡效应结构域（DED），但有的只具有死亡结构域（DD）。 FADD（结合Fas死亡结构域的接头蛋白）：具有DD和DED ；TRADD（结合肿瘤坏死因子受体死亡结构域的接头蛋白）：仅有DD。

Fas起始/介导的外源细胞凋亡途径

TNF-R1起始/介导的外源细胞凋亡途径

（2）依赖于caspases的由线粒体起始/介导的内源细胞凋亡途径：内部凋亡信号（如不可修复的损伤）或外部凋亡信号（如活性氧）激活促凋亡因子（Bid），其C端片段被运送到线粒体与Bax/Bad形成复合物或使线粒体渗透性转换孔（PT）打开 ，导致细胞色素c（ Cyt c ）释放（关键！）；Cyt c与Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子）和caspase-9酶原结合形成凋亡复合体（apoptosome），并活化caspase-9；活化的caspase-9激活下游的caspase-3，最后引起细胞凋亡。 注意1：外源途径中的caspase-8以及细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞分泌的颗粒酶B，也可以切割并活化促凋亡因子Bid，激活内源凋亡途径。 注意2：内源途径中线粒体释放的促凋亡因子Smac（见后文）也能激活caspase-8，从而与外源途径交汇。

Apaf-1（apoptosis protease activating factor 1即凋亡蛋白酶活化因子1 ）：线虫凋亡分子Ced4在哺乳动物细胞中的同源蛋白，N端含有CARD（caspases募集结构域），与细胞色素c结合后发生自身聚合，形成很大的凋亡复合体，招募caspase-9的前体并使之活化，引起细胞凋亡。 Apoptosome（凋亡复合体）：凋亡因子Apaf-1与Cyt.c形成的复合体，相对分子质量为(7~14)×105，细胞质中caspase-9的前体（含有CARD ）被招募到复合体上并发生自身切割而活化，活化的caspase-9再进一步切割并激活caspase-3和-7酶原，引发细胞凋亡。 Caspases依赖性细胞凋亡途径的相似之处：① 起始者caspases（如-8和-9）均在大的复合物中被激活（如DISC和apoptosome）；②接头蛋白在复合物形成中起关键作用：接头蛋白（如FADD和Apaf-1）负责引导起始者caspases进入复合物的适当位置，进而使之发生同性活化。

由线粒体起始/介导的内源途径

细胞凋亡信号途径（图16-7）

Caspase依赖性细胞凋亡途径小结 凋亡途径名称 细胞凋亡途径 Fas起始/介导 的外源凋亡途径 Fas-L →死亡诱导信号复合物（DISC）（Fas聚合 → FADD → Caspase-8酶原）→ Caspase-8 →效应者caspases（-3/-6/-7）→死亡底物→细胞凋亡 线粒体起始/ 介导的内源凋亡途径 细胞内损伤 / Caspase-8 → Bid → Bax / Bad寡聚化 / 渗透性转换（PT）→ 凋亡复合体（Apoptosome）（Cyt.c → Apaf-1 → caspase-9酶原）→ Caspase-9 →效应者caspases（-3/-6/-7）→死亡底物→细胞凋亡

线粒体外膜的通透性主要受到Bcl-2蛋白家族的调控。 Bcl-2（B cell lymphoma gene 2）：即B细胞淋巴瘤基因2蛋白，是线虫抗凋亡蛋白Ced9在哺乳动物细胞中的同源物。 Bcl-2家族成员大多定位在线粒体外膜上，或受信号刺激后转移到线粒体外膜上，调控线粒体外膜通透性，促进或抑制细胞凋亡。Bcl-2家族所有成员均含有一个或者多个BH（Bcl-2 homology）即Bcl-2家族同源结构域，依次命名为BH1~4。 Bcl-2家族按照结构和功能分为3个亚族：① Bcl-2亚族：包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1 等，大多具有BH1~4结构域，抑制细胞凋亡；② Bax亚族：包括Bax、Bak 和Bok，均具有BH1~3结构域，促进细胞凋亡；③BH3亚族：包括Bad、Bid、Bik、Puma和Noxa等，均仅有BH3结构域，能够充当细胞内凋亡信号的“感受器”，促进细胞凋亡。 Bcl-2家族调控线粒体外膜通透性的可能机制：细胞接受凋亡信号后促凋亡因子Bax和Bak发生寡聚化，从细胞质中转位到线粒体外膜上，并与膜上的电压依赖性阴离子通道（VDAC）相互作用，使通道开放到足以使线粒体内的凋亡因子（如Cyt.c）等释放到细胞质中，引发细胞凋亡。抑制凋亡的Bcl-2和Bcl-XL能够 与Bax或Bak形成异二聚体，通过抑制Bax和Bak的寡聚化来抑制线粒体外膜通道的开启。 除了线粒体，caspases的级联激活反应还可能起始于细胞核、高尔基体、溶酶体和内质网等细胞器，但机理不明。

Bcl-2家族成员结构示意图（图16-8）

3. 非caspases依赖性细胞凋亡：线粒体释放的凋亡因子Endo G和AIF等，直接进入细胞核，引发DNA断裂。 AIF（凋亡的诱导因子）：1999年克隆的第一个能够诱导非caspases依赖性细胞凋亡的线粒体外膜蛋白。在凋亡过程中，AIF从线粒体转移到细胞质内，进而进入细胞核内，引起DNA凝集并断裂成50 kb大小的DNA片段。 Endo G（核酸内切酶G）：Endo G 属于Mg2+依赖性的核酸内切酶家族，位于线粒体中，主要负责线粒体DNA的修复和复制。在受到凋亡信号刺激后，Endo G从线粒体中释放出来进入细胞核内，对DNA进行切割，产生典型的以核小体为单位的DNA片段。 凋亡细胞的清除：细胞发生凋亡时，PS（磷脂酰丝氨酸）从细胞质膜脂双层内叶外翻到外叶，向吞噬细胞发生“将我吃掉”的信号。

4. 穿孔蛋白-颗粒酶介导的细胞凋亡：细胞毒性T淋巴细胞（或自然杀伤细胞）是动物体抗御病毒感染和细胞癌变的“生力军”，它们接收刺激后，产生毒性颗粒即穿孔蛋白和颗粒酶，释放到细胞外。在被病毒感染或癌变的靶细胞外，颗粒酶A和B切割细胞外基质蛋白，使靶细胞与基质及周围细胞脱离；同时，颗粒酶A和B在穿孔蛋白的协助下进入靶细胞切割细胞内蛋白，通过caspases依赖性和非依赖性2种方式促使靶细胞凋亡。穿孔蛋白-颗粒酶介导的细胞凋亡在机体免疫防御中发挥重要作用。 穿孔蛋白（perforin）：为跨膜蛋白，能够在靶细胞质膜上形成孔道。 颗粒酶（granzyme）：是一类丝氨酸蛋白酶，主要包括颗粒酶A 、B、H、K和M。① 颗粒酶A：主要通过caspases非依赖性凋亡途径促使细胞凋亡。颗粒酶A能促使位于内质网的SET复合物从内质网上解离下来，转移到细胞核内并活化，切割核DNA；颗粒酶A还可通过切割核纤层蛋白和组蛋白，破坏细胞核和染色体结构的稳定性，更有利于DNA酶的作用。② 颗粒酶B：主要通过caspases依赖性凋亡途径促使细胞凋亡。颗粒酶B切割并活化促凋亡因子Bid，活化的Bid转移到线粒体外膜上，与Bax/Bak一起改变线粒体外膜通透性，释放Cyt.c等促凋亡因子，诱发内源凋亡途径；颗粒酶B也可通过切割凋亡抑制因子Mcl-1诱发内源凋亡途径。

5.生死抉择：细胞凋亡的调控 控制细胞死亡的方式主要有2种：① 大多数细胞都需要获得来自其它细胞的存活信号来维持生存，否则，细胞就会激活自杀程序。② 细胞直接接收到来自其它细胞的死亡信号，激活自杀程序。 细胞存活因子：主要包括多种有丝分裂原和生长因子。它们与细胞表面的受体结合后，启动细胞内信号途径，抑制凋亡的发生。在抗凋亡和保存活的多条信号通路中，转录因子NF-κB处于中心地位，NF-κB激活凋亡抑制因子基因（如bcl-2）的转录，在免疫系统的发育、机体的免疫反应以及抗细胞凋亡等过程中发挥重要作用（见图16-9）。 细胞凋亡抑制因子（c-IAP）：细胞中天然存在的caspases酶原活化及其本身活性的抑制因子家族，主要有Bcl-2亚族的Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-w以及c-IAP家族（见表16-2）。c-IAP家族所有成员都具有由70个氨基酸组成的BIR（棒状病毒IAP重复）结构域，能够直接与caspases活性分子结合，阻抑其对底物的切割作用。 内源性的凋亡激活因子：Smac（caspase活化因子）从线粒体的膜间隙释放出来与c-IAP结合并解除其抑制凋亡的作用；Htra2 / Omi（丝氨酸蛋白酶）从线粒体释放出来切割c-IAP解除其抑制凋亡的作用。当凋亡程序启动后，Bcl-2和c-IAP的抗凋亡作用能够被这些凋亡激活因子解除。 细胞生死抉择调控过程中3种转录因子的作用：p53促进细胞凋亡；NF-κB抑制细胞凋亡；c-Myc给细胞两种选择：增殖或凋亡。

生存因子通过调节Bcl-2家族成员的活性及表达抑制细胞凋亡的发生（图16-9）

内源性caspases抑制因子（表16-2）

二、细胞坏死 细胞坏死（cell necrosis）：细胞受到急性意外强力损伤，如极端的物理、化学因素或严重的病理性刺激而发生的细胞死亡形式。细胞坏死时，Ca2+升高， ATP水平急降，引起一系列变化，如线粒体外膜肿胀而密度增加；细胞骨架破坏；溶酶体酶释放；pH下降；核染色质呈絮状， DNA降解；蛋白质合成减慢；最后细胞膜和细胞器破裂，大量水进入细胞，细胞内含物释放到胞外，引起周围区域的炎症反应。 DNA损伤的积累致使PARP被活化，引发ATP水平急降导致细胞坏死。 实际上，细胞坏死也可能是信号转导引发的增殖细胞发生的“程序性死亡”。 细胞坏死可能在细胞的免疫反应中发挥重要作用。

细胞坏死与凋亡的形态区别

三、自噬性细胞死亡 细胞自噬（autophagy）：是细胞通过溶酶体与大的双层膜包裹的细胞自身物质融合，从而降解细胞自身物质的过程。通常，寿命比较短的蛋白质（如调控蛋白）通过泛素-蛋白酶体系统进行降解；而寿命比较长的细胞结构及蛋白质则通过细胞自噬途径，由溶酶体进行降解。 自噬小体（autophagosome）：细胞自噬的特征是细胞中出现大的双层膜包裹的自噬泡，称为自噬小体。自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体而消化（见图16-10）。 细胞自噬的分子机制目前还不是很清楚：酵母细胞中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号途径是了解得比较明确的细胞自噬途径（见图16-11）。 细胞自噬是促使细胞存活的自我保护机制：一是在非常时期为细胞生存提供原料或ATP；二是细胞自噬具有自我“清理”功能。 细胞自噬可能是细胞凋亡的补充途径：细胞依靠降解自身物质来产生能量，但最终导致死亡。细胞自噬不需要吞噬细胞的协助就能进行自我销毁，因此能够在需要大量细胞死亡的变态过程中发挥作用。

细胞自噬的特征及过程（图16-10）

酵母中细胞自噬的信号调控（图16-11） Akt ＝ PKB mTor ＝ PDK2 参考图9-30

四、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡 （一）植物细胞的程序性死亡 （二）酵母细胞的程序性死亡

（一）植物细胞的程序性死亡 植物的正常发育和对环境的反应都离不开细胞程序性死亡：在正常的植物发育进程，如导管的分化、通气组织的形成、糊粉层的退化、绒毡层细胞的死亡、胚柄的退化、单性植物中花器官的程序性退化等，以及对环境胁迫，如缺氧、高盐等的反应和病原体入侵引发的过敏反应中，均存在细胞程序性死亡过程。 植物细胞程序性死亡的最大特点：死亡细胞的残余物被细胞壁固定在原位，不是被周围细胞吞噬，而是被自身液泡中的水解酶消化。 植物细胞程序性死亡的的形态学变化：① 在过敏反应中，可观察到染色质凝聚，DNA降解为50kb片段，细胞膜及液泡膜皱缩破裂，质壁分离，末期细胞内含物泄漏到质外体；② 在管状细胞分化的凋亡过程中，细胞壁增厚，随着液泡膜的破裂，核DNA被迅速降解，细胞内含物被水解消化，最后仅剩下细胞壁。 能够诱导植物细胞发生程序性死亡的因素有多种：主要包括活性氧和植物激素等。水杨酸和NO能够协同促进植物过敏反应中的细胞程序性死亡；赤霉素和乙烯能够促进细胞程序性死亡，而细胞分裂素和脱落酸则能够抑制。

植物细胞程序性死亡的形态学模式图（图16-12） A：在过敏反应中 B：在管状细胞分化的凋亡过程中

（二）酵母细胞的程序性死亡 能够诱导酵母发生细胞程序性死亡的因素：低浓度的H2O2或醋酸，较高浓度的盐或糖，植物抗真菌多肽等。 酵母程序性死亡的形态学特征与动物细胞凋亡类似：DNA发生凝聚、边缘化和断裂，Cyt.c从线粒体释放等。 酵母细胞程序性死亡机制与动物细胞的凋亡机制有类似之处：如有caspases、凋亡激活因子或凋亡抑制因子等的类似物。 酵母程序性死亡的意义：促进酵母的接合繁殖（未接合者死），形成更优势的“杂合体”；使有限的营养供给具有最佳适应性的个体（“衰老”者死）；不同种酵母展开营养源“争夺战”时释放毒素，导致其它种属的酵母发生程序性死亡。

第二节 细胞衰老 一、细胞衰老的概念与特征 二、细胞衰老的分子机制 三、细胞衰老与个体衰老的关系

一、细胞衰老的概念与特征 细胞衰老（cell ageing，cell senescence）：一般含义是复制衰老（replicative senescence），指正常细胞经过有限次数的分裂增殖后，停止生长，细胞形态和生理代谢活动发生显著退化的过程。 Hayflick 界限（Hayflick limit）：除了干细胞和癌细胞，正常的体外培养的细胞增殖能力和寿命不是无限的，而只能进行有限次数（约50次）的增殖。1958年Hayflick等人证实人成纤维细胞的复制能力是有限的，首次提出了细胞水平上的“衰老”现象。 对于体外培养细胞的细胞衰老研究，当前常用的生物学特征有2个：① 不可逆的生长停滞：细胞停止分裂；② 衰老相关的β-半乳糖苷酶（SAβ-gal）的活化：衰老细胞中存在的pH6.0条件下即表现活性的溶酶体β-半乳糖苷酶。

衰老相关β-半乳糖苷酶染色区分年轻和衰老的人胚胎成纤维细胞IMR-90（图16-13） A：第20代的年轻细胞 B：第55代的衰老细胞

衰老细胞的形态变化 结构 形态变化 细胞核 增大、染色深、核内有包含物 核膜 内陷 染色质 凝聚、固缩、碎裂、溶解 质膜 粘度增加、流动性降低 细胞质 色素积聚、空泡形成 线粒体 数目减少、体积增大 高尔基体 碎裂 尼氏体 消失 包含物 糖原减少、脂肪积聚

二、细胞衰老的分子机制 （一）复制衰老的机制 （二）压力诱导的早熟性衰老 （三）单细胞生物的衰老

（一）复制衰老（RS）的机制 线性染色体的“末端复制”问题：在DNA复制时，由于DNA聚合酶不能从头合成子链，当子链5’端与母链3’端配对的RNA引物被切除后，子链5’端会产生末端缺失，使得子链的5’端随着复制次数的增加而逐渐缩短。 端粒（telomere）和端粒酶（telomerase）：①端粒是位于染色体末端的由重复序列组成的“帽子”结构，对染色体结构稳定和末端复制等有重要作用。②端粒酶是含有RNA的反转录酶，能以自身RNA为模板，对DNA端粒序列进行延长而解决线性染色体末端复制问题。 复制衰老的机制—端粒假说：端粒的缩短（一种DNA损伤）被p53识别，然后通过p53-Rb信号通路导致细胞衰老（图16-14）；端粒酶（端粒计数器）能够弥补端粒的缩短，导致细胞的永生化。

复制衰老的信号途径（图16-14）

（二）压力诱导的早熟性衰老（SIPS） 压力诱导的早熟性衰老（SIPS）：除了细胞内端粒缩短可以诱发复制衰老以外，许多刺激因素，如离子辐射、过量的氧、乙醇和丝裂霉素C等均能够缩短细胞的复制寿命，促进细胞衰老。SIPS与RS的机制相似。 氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧（ROS）成分（O2-， OH·，H2O2），对核酸、蛋白质和脂质造成损伤并使线粒体DNA发生特异性突变，引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。

（三）单细胞生物的衰老 酵母的复制生命周期（RLS）：指酵母母细胞在衰老前产生子细胞的数量。 rDNA（rRNA基因）与衰老：酵母的染色体外的环形rDNA（ERC）的积累（因同源重组），掠夺了DNA正常复制和转录所需的重要物质，从而抑制了细胞的增殖，导致酵母细胞衰老。 SIR2/3/4和SGS1基因与抗衰老： SIR2/3/4和SGS1基因均能抑制酵母染色体上重复rDNA的同源重组，即抑制ERC的产生，使得酵母的复制生命周期（RLS）显著增加。 线粒体DNA（mtDNA）与衰老：mtDNA突变积累与细胞衰老有关。

酵母中染色体外的环形rDNA（ERC）生成示意图（图16-15）

三、细胞衰老与个体衰老的关系 由于体外培养细胞与体内细胞存在较大差异，迄今还未有实验证据表明体外培养细胞的衰老现象与个体的衰老有直接的关联。 细胞衰老可以看做是有机体在长期演化过程中形成的防止细胞过度生长即癌化的一种机制。 体内细胞衰老的机制仍有待研究。

本章概要（一） 细胞死亡往往受到细胞内某种由遗传机制决定的“死亡程序”控制，所以被称为细胞程序性死亡。动物细胞典型的程序性死亡方式包括凋亡与坏死。细胞凋亡对于生物体的正常发育、自稳平衡及多种病理过程具有极其重要的意义。其最重要特征是凋亡过程中细胞膜保持完整，细胞内含物没有泄漏到细胞外，不引发机体的炎症反应。这也是细胞凋亡与坏死的主要区别。细胞凋亡的另一个重要特征是染色质DNA在核小体间发生断裂，形成间隔200 bp的DNA片段。在动物细胞的凋亡过程中，半胱氨酸蛋白酶caspases家族成员发挥了重要作用。caspases依赖性的细胞凋亡主要通过两条途径引发：由死亡受体起始的外源途径和由线粒体起始的内源途径。同时细胞内还存在不依赖于caspases的凋亡途径。细胞中存在caspases抑制因子。在细胞生存/死亡的抉择调控过程中，细胞存活因子通过抑制细胞凋亡来维持细胞存活，而p53能够促进细胞凋亡的发生。与动物细胞相比，植物细胞和酵母的程序性死亡的分子机制还有待进一步研究。

本章概要（二） 细胞衰老主要指复制衰老，是体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止生长，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。1958年Hayflick等人证实人成纤维细胞的复制能力是有限的，首次提出了细胞水平上的“衰老”现象，称为“Hayflick界限”。细胞在衰老过程中，其结构发生一系列变化。关于复制衰老的分子机制，目前有多种假说。其中端粒假说认为端粒的缩短能够通过p53，Rb信号通路导致细胞衰老；端粒酶能够弥补端粒的缩短，导致细胞的永生化。由于体外培养细胞与体内细胞存在较大差异，迄今还未有实验证据表明体外培养细胞的衰老现象与个体的衰老有直接的关联。细胞衰老可以看做是有机体在长期演化过程中形成的防止细胞过度生长即癌化的一种机制。体内细胞衰老的机制仍有待研究。