第七章动物细胞培养 动物细胞培养方法 动物细胞、组织培养体外培养的特点： 1．营养基需求更苛刻：氨基酸、维生素、盐类、辅酶、核酸、生长因子、葡萄糖或半乳糖，血清等。 2．培养环境和条件要求更高： pH值：最适为7.2～7.4 溶解氧：5％CO2+95％空气的混合气体 温度：最适温度37℃ 剪切力：一般都是静止培养 3．易污染：因动物细胞培养时间长。 大多数细胞能耐受的培养液pH范围为6.8～7.6；人和大多数哺乳动物培养细胞的最适温度在37℃左右。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。细胞培养在39～40℃中1小时，即会受到一定损伤，但仍能恢复。当在41～42℃的温度条件下培养1小时，细胞则会受到严重损伤，但不致于全部死亡，部分仍可能恢复。当温度达43℃以上时，细胞大多死亡。 O2参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能量； CO2主要与维持培养液的酸碱度有直接关系。必要时，可通入N2以稀释O2，调节培养箱内O2的浓度。

动物细胞培养方法 动物细胞培养培养基种类为： 1. 天然培养基 2. 合成培养基 3. 无血清培养基

动物细胞培养方法 1. 天然培养基： ① 血清：常用胎牛血清（FBS）、小牛血清（CS）。一般浓度10％ ② 鸡血浆：含纤维蛋白原和一些营养成分 ③ 水解乳蛋白（LH） ④ 鼠尾胶原

动物细胞培养方法 2. 合成培养基 MEM培养液(Minimum Earle Medium) 109培养液 NCTC培养液 DMEM培养液(Dulbecco改良设计) RPMI－1640 培养液 199培养液 F12培养液

动物细胞培养方法 3. 无血清培养基 基础营养液 大多使用F12、DMEM培养液、RPMI－1640培养液、199培养液等 附加成分（补充成分） 如为促贴壁成分、胰岛素、转铁蛋白。胰高血糖、其他生长因子、蛋白酶抑制物等

动物细胞培养方法 动物细胞培养必需的溶液： ① 平衡盐水（BBS）： 常用有Hanks液、PBS、Earle液。 ② 培养基pH调整液： 常用3.7%、5.6%、7.4%NaHCO3溶液、HEPES液（二羟乙基派嗪乙烷磺酸） ③ 细胞消化液：常用胰蛋白酶溶液，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液 ④ 抗生素溶液：一般是青霉素和链霉素

动物细胞培养方法 体外动物细胞培养一般过程： 组织获得→ 组织消化→ 接种细胞→原代培养→传代培养→冻存与复苏。 原代培养分为两种： 1.组织块培养法 2.组织消化培养

动物细胞培养方法 1．组织块培养： 基本步骤：无菌取出目的组织 ↓ 用利刀无菌切割成1～2mm小块 ↓以Hanks液漂洗干净,低速离心，弃上清 移入培养瓶，加入适当培养基浸润 培养瓶翻转1800，置15～30分，使其贴壁 培养瓶翻回，置于37℃培养

组织块分离

动物细胞培养方法 2．组织消化培养 无菌取出目的组织 ↓ 用利刀无菌切割成细块 胰蛋白酶液消化 Hanks液漂洗两次，低速离心弃上清 吸管吹打分散细胞 移入培养瓶薄层培养

组织消化培养过程

动物细胞培养方法 传代培养技术 基本步骤： 吸出培养瓶内旧培养液 ↓ 加入胰蛋白酶和EDTA混和液 吸出消化液，加入Hanks液终止消化 吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数 重新接种

传代培养

动物细胞培养方法 体外细胞生长过程： 潜伏期、指数生长期、平衡期、衰亡期。 动 物 细 胞 生 长 曲 线

动物细胞培养方法 动物细胞体外培养方法： 1. 悬滴培养法 2. 旋转管培养法 3. 灌注小室培养法 4. 培养瓶培养方法 5. 培养板培养法

动物细胞培养方法 1. 悬滴培养法 又称植块悬滴培养法，1907年，哈里森首创。即将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂于盖玻片下，再置于一凹形载玻片上，最后用熔蜡密封后放于培养箱中培养。 优点： 1）容易换片。 2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。

动物细胞培养方法 2. 旋转管培养法 盖尔（Gey，1933年）、刘易斯（Lewis，1934年）建立该方法。 特点：是培养中组织块或细胞交替地与培养液和空气直接接触。包括旋转管、旋转鼓、支架等。 缺点：不易在显微镜下观察。

动物细胞培养方法 3. 灌注小室培养法 在盖玻片悬滴法基础上发展而来，可用于连续观察细胞动态变化，研究各种因素影响作用及活细胞反应。1912年由伯罗（Burrows）首创。

动物细胞培养方法 4. 培养瓶培养方法 卡式瓶 指将培养对象直接接种于培养瓶内培养。 1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶。Earle设计了T－培养瓶。 通气性好，附着面宽阔，营养丰富，可大量培养细胞，易于观察。 卡式瓶 T-培养瓶

培养瓶内培养细胞

动物细胞培养方法 5. 培养板培养法 又称微量培养法，将细胞接种在微量培养板进行细胞培养，一般是一次性使用。 可进行微量的细胞培养（100μL），可进行多种指标和细胞处理，方便显微镜观察。

动物细胞培养方法 细胞冷冻保存技术： （1）预保留细胞经消化分散后，用冷冻保护液，将细胞悬浮液稀释成2×106～5×106cells/ml。 （3）将封口的瓶放入慢冷冻机内，按每分钟1℃的速度，缓慢冷冻，使温度降至－25℃。 （4）冻结好的瓶放入CO2 低温冰柜或液氮罐中,温度-150～-190℃。 （5）如果需要复苏,可将冰冻的细胞悬液瓶取出后立即放入37℃水浴中,使其快速熔化。要慢冻快融。

动物细胞培养方法 与植物细胞的区别 1.培养基不同：植物细胞（固体培养），动物细胞（液体培养） 。 2.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物细胞培养则不需要。 3.产物不同：植物细胞培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般得到的是同一种的细胞的细胞系（细胞群） 。 4.原理不同：植物细胞培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。 5.过程不同：植物细胞培养的过程为脱分化和再分化，动物细胞培养的过程为原代培养和传代培养。

动物细胞培养方法 动物细胞大规模培养技术： 利用生物反应器高密度大量培养动物细胞的方法。 1．悬浮培养技术 2．微载体培养技术 3．多孔载体培养 4．微囊化培养技术 5．中空纤维法 动物细胞生物反应器大规模培养的应用， 生产的生物制品主要种类为： 疫苗类；单克隆抗体；其它基因重组蛋白类，免疫球蛋白，细胞因子等。

动物细胞培养方法 动物细胞培养污染及防治： 污染途径：污染物特别是微生物污染途径。 ①空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩。 ②器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净，CO2培养箱等如果不定期消毒，可能形成污染。 ③操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。 ④血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染源。 ⑤组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，影响细胞生长。 空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。

动物细胞培养方法 动物细胞培养污染及防治： 污染类型： ①细菌污染：常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。 ②真菌污染：微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异。 ③支原体污染：细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题，是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。其最小直径为0.2μm，但约有1％可以通过滤菌器。 ④细胞交叉污染：细胞交叉污染也是培养操作过程中的污染的一大方面。 支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可以用于传代、换液而缓解，外观上给人以正常感觉，实则细胞受到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。但个别严重者，可以导致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。为确定有无支原体污染可以利用相差油镜观察。

动物细胞培养方法 动物细胞培养污染及防治： 污染的预防： 防止污染，预防是关键。 污染的排除： ① 抗生素排除法：联合应用，提高使用浓度。 ② 加温除菌：根据支原体对热敏感的特点，可以实行加温 处理，一般可以将受支原体污染的细胞放置在41℃作用上5～10小时。 ③ 与巨噬细胞共培养：在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活7～10天。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。