生物制品分析概论 第二军医大学药学院

本章内容 背景概述 鉴别试验 杂质检查 含量（效价）测定

第一节 背景概述 一、生物药物与生物制品 生物药物（Biopharmaceutics或Biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。 广义的生物药物应包括从动物、植物和微生物等生物体中直接制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。

生物药物发展 第一代生物药物：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物质与混合成分的粗提物制剂 甲状腺粉及其片剂、鱼肝油与鱼肝油酸钠注射液、胰酶及其肠溶片、肠溶胶囊等 第二代生物药物：根据生物化学和免疫学原理，应用近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成分 尿激酶、肝素钠、抑肽酶、胰岛素、人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子Ⅷ、人纤维蛋白原

生物药物发展 第三代生物药物：应用生物工程技术生产的天然生理活性物质，以及通过蛋白质工程原理设计制造的具有比天然物质更高活性的类似物，或与天然物质结构不同的全新的药理活性成分。 重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人干扰素1b、重组人白细胞介素-2、重组人红细胞生成素（EPO）等 生物药物分类 生化药物 生物合成药物 生物制品

生物药物分类 生化药物:一般系指从动物、植物及微生物提取的，也可用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰物等，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、脂质、核苷酸类等。 生物合成药物:由微生物代谢所产生的药物和必须利用微生物及其酶转化反应共同完成的半合成药物，如山梨醇、木糖醇、甘露醇、枸橼酸、氨基酸、维生素、生物碱、甾体激素、抗生素和一些核苷酸、酶与辅酶类药物等。

生物药物分类 生物制品: 以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断。 生长激素释放抑制激素的生产： 10万只羊下丘脑—1mg—10L大肠杆菌工程菌株发酵液 核酸疫苗制备技术路线： 目的抗原基因的选择与分离→与载体DNA连接→转入宿主扩增质粒→重组质粒提取、纯化与后处理

二、生物制品的种类与特点 疫苗类药物——细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗和类毒素 抗毒素及抗血清类药物——破伤风抗毒素等 血液制品——人血白蛋白、人免疫球蛋白、人纤维蛋白原 生物技术制品 ——重组人表皮生长因子凝胶（酵母）、重组人p53腺病毒、基因工程乙肝疫苗、单克隆抗体等 微生态活菌制品——如双歧杆菌活菌胶囊、地衣芽孢杆菌活菌颗粒、酪酸梭菌活菌片等 诊断制品——体外诊断制品（HBsAg酶联免疫诊断试剂盒）、体内诊断试剂

二、生物制品的种类与特点 分子量不定值——不同的相对分子质量产生不同活性 生化法结构确证——定期监测制品肽图 需检查生物活性——生物检定法证实活性 安全性检查——宿主蛋白残留量，提取溶剂残留量 效价测定——酶活力测定

三、生物制品全程质量控制 注射用重组链激酶产品的全程质量控制过程 三、生物制品全程质量控制 注射用重组链激酶产品的全程质量控制过程 操作过程 具体项目 法定标准 1 基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等 符合“凡例”的有关要求 2 制造 2.1 工程菌菌种 名称与来源 带有链激酶基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株 种子批的建立、菌种检定 应符合规定 2.2 原液 种子液制备、发酵用培养基 种子液接种及发酵培养 按工艺操作 发酵液处理、初步纯化、高度纯化 按工艺操作，纯度符合规定 原液检定 按3.1项进行 2.3 半成品 配制与除菌、半成品检定 工艺按规定操作，检定按3.2项进行 2.4 成品 分批、分装与冻干、规格、包装

3 检定 3.1 原液检定 生物学活性、蛋白质含量、比活性 依法测定，应符合规定 纯度 电泳法、HPLC测定，纯度不低于95.0％ 分子量 还原型SDS-PAGE法测定，为47.04.70kD 外源性DNA、宿主菌蛋白残留量以及残留抗生素 细菌内毒素 等电点 主区带应为4.65.6 紫外光谱扫描 最大吸收波长应为2773nm 肽图 依法测定，应与对照品图形一致 N-末端氨基酸序列 Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Leu-Leu-Asp 3.2 半成品检定 细菌内毒素、无菌检查 3.3 成品检定 鉴别试验、物理检查、化学检定 生物学活性 应为标示量的80％150％ 无菌、细菌内毒素、异常毒性检查

对生物制品的质量控制重点 ①有效成分的同一性、结构确证； ②有效成分的均一性、纯度检验； ③有害物质及残余杂质（特殊杂质）等的控制； ④高效、灵敏的生物活性及比活性等实验方法。 为了正确反映生物制品的性质与特性，生物制品质量控制的基本方法一般应包括鉴别试验、杂质检查、安全性检查和含量（生物学活性或效价）测定。

第二节 鉴别试验 依据生物制品的化学结构、理化性质和生物学特点，利用化学法、物理法及生物学方法进行某些特殊反应，或测定某些专属的理化常数如紫外吸收系数、等电点、电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，来判断与确证产品的真伪。 需要标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。 生物制品的鉴别不是由一项试验就能完成，而是依据其特异的分子结构和(或)其他特性(包括理化性质和生物学活性等)设计一组试验来全面评价一种药物。

一、理化鉴别法 化学法：通常利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。 紫外分光光度法： 蛋白质类生物制品——蛋白质变性反应 胰蛋白酶+对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐→紫色 胃蛋白酶+鞣酸、没食子酸或多数重金属盐的溶液→沉淀 紫外分光光度法： 蛋白质类生物制品的紫外吸收光谱是由于芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸光吸收的结果。 对于一个蛋白或多肽分子来说，它的最大吸收波长是固定的，不同批次产品的紫外光谱图也应该是一致的。

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经胰蛋白酶裂解后的 RP-HPLC（左）和CZE（右）肽图典型谱图 一、理化鉴别法 高效液相色谱法： 基于生物制品供试品溶液和对照品溶液色谱图中主峰保留时间和肽图的一致性，可用于目的产品的鉴别。 重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经胰蛋白酶裂解后的 RP-HPLC（左）和CZE（右）肽图典型谱图

一、理化鉴别法 示例：胰岛素的鉴别 （1）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。 （2）取本品适量，用0.1％三氟醋酸溶液制成每lml中含10mg的溶液，取20μl，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.3)20μl、0.1％V8酶溶液20μl与水140μl，混匀，置37℃水浴2小时后，加磷酸3μl，作为供试品溶液；另取胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。

一、理化鉴别法 照含量测定项下的色谱条件，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(90:10)为流动相A，乙腈-水(50:50)为流动相B，按右表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。 时间 （分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 90 10 60 55 45 70

二、生化鉴别法 酶法：利用酶对底物特异性的催化活力，可以作为酶类生物制品简便、快速、灵敏的鉴别方法。 尿激酶的鉴别 ： 尿激酶 用巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)溶解 成1ml(含20单位) +牛纤维蛋白原溶液0.3ml 再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液0.2ml，牛凝血酶溶液0.2ml，迅速摇匀，立即置37℃0.5℃恒温水浴中保温，记时，反应系统应在30s45s内凝结，且凝块在15min内重新溶解。 以0.9％氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2h内不溶。

二、生化鉴别法 电泳法：应用电泳技术如等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等，获得目的产品的一致性、同一性的电泳图谱和数据，可用于蛋白质类生物制品的鉴别。 等电聚焦电泳用于检测蛋白质类生物制品的等电点，例如中国药典2010年版三部收载的重组人干扰素1b、2a、2b和等电点，依法测定，主区带应分别为4.06.5、5.56.8、4.06.7和8.19.1。

二、生化鉴别法 示例：重组人生长激素的鉴别 取本品，加水溶解制成每1ml中含1mg的溶液，取此溶液90μl，加两性电解质10μl和甲基红试液2μl，混匀，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品，同法制备，作为对照品溶液。取对照品溶液和供试品溶液各10μl，加至上样孔，照等电聚焦电泳法（附录Ⅴ F第六法）试验，供试品溶液主带位置应与对照品溶液主带位置一致。

三、生物鉴别法 血清学法 体外抗原抗体试验。抗原抗体反应具有高度的特异性，只要一方已知，即可检测出另一方。如凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应，以上四种类型反应即所谓的经典血清学反应。

三、生物鉴别法 示例：人血白蛋白的鉴别 采用免疫双扩散技术，依法测定（附录Ⅷ C），供试品仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊的血清不产生沉淀线。选择免疫电泳技术，依法测定（附录Ⅷ D），供试品与正常人血清比较，主要沉淀线应为白蛋白。

三、生物鉴别法 生物学法 利用生物体对生物制品特定的生物活性的反应为基础进行供试品的鉴别即为生物学法。

三、生物鉴别法 示例：注射用重组人促红素（CHO细胞）

第三节 杂质检查 生物制品的杂质检查可用来判定产品的优劣。一般地，只要在不影响临床疗效及人体健康的原则下，药品质量标准可以允许生产过程和贮藏过程中引入的微量杂质的存在。 生物制品来自生物体，生物活性特异性强，制造与纯化工艺复杂，分子结构常常不确定，有时产品成分并非单一，极微量杂质可能产生显著的效应，因此，生物制品的杂质检查就显得尤为重要，涉及的项目也各有特点，主要包括一般杂质检查、特殊杂质检查和安全性检查。

一、特殊杂质检查 特殊杂质是指药品在生产和贮藏过程中可能引入的特有杂质。 特殊杂质检查意义是特殊杂质可能存在的毒性会引起安全性问题；可能影响产品的生物学活性和药理作用，或使产品变质；也反映产品生产工艺的稳定性。 生物污染物——微生物、外源性DNA等 产品相关杂质——二聚体，多聚体，突变物等 工艺添加剂——残余抗生素，甲醛，吐温80，曲拉通X-114等

（一）宿主细胞（菌）蛋白残留量 中国药典2010年版均采用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 加入专一性底物，反应后测定492nm吸光度值 加入辣根过氧化酶标记的抗体 洗涤 加入供试品 菌体蛋白与抗体结合 兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体 菌体蛋白 含量 酶标板固相

示例： ELISA法检测大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体蛋白含量 1、在测定时，受检标本(测定其中的残留菌体蛋白抗原)与固相载体表面的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体起反应； 2、通过洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开； 3、加入辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体，也形成抗原抗体复合物而结合在固相载体上。

示例： ELISA法检测大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体蛋白含量 4、因此，固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例； 5、加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关； 6、故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使宿主细胞（菌）残留蛋白测定方法达到很高的敏感度，以保证生物制品的安全有效。

具体操作： 取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释成每1ml中含l0g的溶液，以100l/孔加至96孔酶标板内，4℃放置过夜(16h18h)。用洗涤液洗板3次；用洗涤液制备1％牛血清白蛋白溶液，以200l／孔加至板内，37℃放置2h；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以1001／孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入两孔空白对照(稀释液)，37℃放置2h；用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000倍，以1001／孔加至板内，37℃放置1h，用洗涤液洗板10次，以1001／孔加入底物液，37℃避光放置40min，以50l／孔加入终止液终止反应。用酶标仪在492nm波长处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。 以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白含量。

（二）外源性DNA残留量 随着生物技术的发展以及人们对细菌、病毒和细胞的长期研究与不断认识，制造生物制品的宿主细胞（菌）残留DNA（外源性DNA）的安全性问题逐步清晰，大样本、长时间的临床试验进一步证实生物制品中外源DNA不应该视为一个潜在的危险因素，而是作为生物制品中一个不纯的、应该去掉的杂质成份来对待，为此有关外源性DNA的限量要求也随之放宽。 外源性DNA的测定方法目前主要有三种，即分子杂交（Hybridization）技术、基于DNA结合蛋白(Threshold®)分析系统和实时定量PCR（Q-PCR）方法。

生物制品中外源性DNA残留检测方法的比较 Hybridization Threshold Q-PCR 特异性 物种特异性 无特异性 序列特异性 检测的最小序列长度(bp) 50 600 150 抗干扰性和稳定性 ++ + 所需时间（h） 48 6 2 灵敏度（pg） 10 <1 初期花费（￥） 10000 >320000 >560000

（三）产品相关杂质 常用的分离测定方法有高效液相色谱法和电泳法。 产品相关杂质是生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏保存过程中产生的与产品结构类似的同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体和降解产物等。 产品相关杂质在生物制品中可能被认为是活性成分，而且经验表明许多产品相关杂质是均匀的和非免疫原性的，但由于生物效应没有经过严格的安全性试验研究，应制定允许的限度加以控制。 常用的分离测定方法有高效液相色谱法和电泳法。

示例：重组人生长激素产品中高分子蛋白质 取本品适量，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）制成每1ml中含重组人生长激素1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。 照分子排阻色谱法测定，以适合分离分子量为500060000球状蛋白的色谱用亲水硅胶为填充剂；异丙醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠5.18g，磷酸二氢钠3.65g，加水950ml，用85%磷酸溶液调节pH值至7.0，加水至1000ml）（3︰97）为流动相；流速为每分钟0.6ml；检测波长为214nm。

取重组人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）（取0.063 mol/L 磷酸盐缓冲液1→2.5）制成每1ml中含1.0mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，重组人生长激素单体与二聚体的分离度应符合要求。 取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，高分子蛋白质含量不得过4.0%。

（四）残余抗生素 对于生物制品的制造工艺，原则上不主张使用抗生素。例如中国药典2010年版三部收载的注射用重组人干扰素2a（酵母）和注射用重组人促红素（CHO细胞）产品生产的各个环节均严格限制抗生素使用，故产品的检定包括原液、半成品、成品不必检查残余抗生素活性。 如果生物制品在生产过程中使用了抗生素，则不仅要在纯化工艺中去除，而且要在原液检定中增加残余抗生素活性的检测项目。 依据中国药典2010年版三部附录ⅨA抗生素残留量检查法可以检测残余氨苄西林或四环素的活性。该法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，检查供试品中氨苄西林或四环素残留量。

二、安全性检查 来自生物体的生物制品由于自身独特的大分子结构、高效的生物活性以及制造、纯化、贮藏过程带来的潜在危险因素，使安全性检查成为生物制品质量标准中的一个必不可少的检查项目，是保证临床用药安全、有效的重要指标。 《中国药典》(2010年版)对于生物制品安全性检查的主要项目包括以下几个方面： 无菌检查法、热原检查、细菌内毒素检查、异常毒性检查法、支原体检查法、病毒外源因子检查法、微生物检查法和鼠源性病毒检查法。

第四节 含量（效价）测定 理化分析法、生化测定法和生物检定法 定量表征生物制品的方法通常有两种： 用百分含量表示，适用于成分已知、结构明确的生物制品 用生物效价或酶活力单位表示，适用于大多数酶类和蛋白质类生物制品

一、理化分析法 滴定法： 示例：胰酶中胰淀粉酶的测定 利用氧化还原反应，以1％可溶性淀粉溶液为底物，经胰淀粉酶水解后产生还原糖，在碱性溶液中过量的碘滴定液氧化生成的还原糖，而剩余的碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液滴定至无色。根据每1ml碘滴定液（0.05 mol/L）相当于9.008mg无水葡萄糖的滴定度来推算还原糖的含量，进而求得每1g胰酶中含胰淀粉酶的活力（单位）。

一、理化分析法 光谱法： 蛋白质制品的含量测定，既可以根据在280nm左右有最大吸收直接测定，也可以利用蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应而进行含量测定，选择的依据取决于测定方法的专属性、稳定性和简便性。 中国药典2010年版二部收载的胰蛋白酶的效价测定是基于酶活力的选择性和底物产物的光谱特性，即根据胰蛋白酶与底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯作用后生成的产物在253nm处的吸收度值的变化来进行胰蛋白酶的效价测定。

一、理化分析法 高效液相色谱法： 反相高效液相色谱法测定重组人胰岛素的含量 取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释至每1ml中约含10单位的溶液（临用新配）。精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以人胰岛素峰面积计算，即得。

分子排阻色谱法（size-exclusion chromatography，SEC） 也称凝胶色谱法（gel chromatography），是快速分离不同分子量混合物的色谱方法，广泛应用于多肽和蛋白质等生物制品的分离分析及其分子量的测定。 分子排阻色谱柱常用的固定相是亲水性有机凝胶（如葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅胶或改性硅胶，流动相是可以溶解样品的低黏度缓冲溶液或有机溶剂-缓冲液混合溶液等。

分子排阻法应用特点 （1）生物活性蛋白质可以回收制备。 （2）色谱分离是在固定比例的水溶液体系中进行的。 （3）色谱分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的。 （4）分子排阻色谱法峰容量有限，在整个色谱图上一般只能容纳1012个色谱峰，分离度低。

一、理化分析法 示例：分子排阻色谱法测定重组人生长激素的含量 1、照分子排阻色谱法测定，以适合分离分子量为500060 000球状蛋白的色谱用亲水硅胶为填充剂；以异丙醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠5.18g，磷酸二氢钠3.65g，加水950ml，用85%磷酸溶液调节pH值至7.0，加水至1000ml）（3︰97）为流动相；流速为每分钟0.6ml；检测波长为214nm。

一、理化分析法 2、取人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）（取0.063mol/L磷酸盐缓冲液1→2.5）制成每1ml中含1.0mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，重组人生长激素单体与二聚体的分离度应符合要求。 3、取本品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液，精密量取20μl注入色谱仪，记录色谱图；另取重组人生长激素对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

二、生化分析法 （一）电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳法 琼脂糖凝胶电泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 毛细管电泳法

示例：重组人胰岛素及其相关物质的毛细管区带电泳分析 亲水性多肽、蛋白质成分在反相色谱柱上保留较差， 且疏水性相同或相近的多肽、蛋白质成分采用一般的RP-HPLC条件不易分离 电泳条件 石英毛细管柱(Beckman) 75 m ×57 cm，有效长度50 cm；电极缓冲液 0.05 mol/L 醋酸钠-0.85 mol/L 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈。每次进样前，依次用0.1 mol/L氢氧化钠溶液、电极缓冲液清洗毛细管柱3 min；压力进样6 s，进样后再进5 s电极缓冲液；分离电压16 kV；检测波长214 nm，柱温30℃。在上述电泳条件下进行对照品溶液、供试品溶液的CZE法分析 。

重组人胰岛素及其相关物质的毛细管区带电泳分析典型谱图 1. 苯酚 2. 重组人胰岛素 3. 相关物质 注射剂样品测定结果（标示量％，n=3） 注射剂批号 CZE法（RSD%） RP-HPLC法（RSD%） 970522 98.1（0.76） 97.4（0.42） 970530 97.6（0.72） 97.6（0.22） 970630 98.1（0.36） 98.1（0.33）

（二）酶分析法 以酶能专一而高效地催化某化学反应为基础，通过对酶反应速度的测定或对底物、生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量。 以酶为分析对象，目的在于测定样品中某种酶的含量或活性——“酶活力测定” 以酶为分析工具或分析试剂，主要用以测定样品中酶以外的其它物质的含量——“酶法分析” 以酶能专一而高效地催化某化学反应为基础，通过对酶反应速度的测定或对底物、生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量。

取样测定法、连续测定法（紫外光谱法、荧光分析法、旋光度法） 酶反应的速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应的速度愈快则表示酶的活力愈高。 酶的活性单位（国际单位IU）：是指在25℃下，以最适宜的底物浓度、最适宜的缓冲液离子强度以及最适宜的pH值诸条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。酶的比活性即定为一毫克酶的活性单位。 酶促反应的条件 ： 底物、pH值、温度、辅助因子、空白和对照、线性关系 酶活力测定方法： 取样测定法、连续测定法（紫外光谱法、荧光分析法、旋光度法）

示例：胃蛋白酶的效价测定 胃蛋白酶催化血红蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸。利用胃蛋白酶催化特性和水解产物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的紫外吸收光谱，可以进行胃蛋白酶的效价测定。 测定法 取试管6支，其中3支各精密加入对照品溶液1ml，另3支各精密加入供试品溶液1ml，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5ml，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，摇匀，滤过，取续滤液备用。

另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置37℃±0 另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置37℃±0.5 ℃ 水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供试品溶液1ml，另1支加上述盐酸溶液1ml，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm的波长处测定吸光度 每1g 含蛋白酶活力（单位）= （A Ws n）/（As W10181.19） 式中 As为对照品的平均吸光度； A为供试品的平均吸光度； Ws为每1ml对照品溶液中含酪氨酸的量（g）； W为供试品取样量（g）； n为供试品稀释倍数； 181.19为酪氨酸的分子量。

示例：胰蛋白酶的效价测定 胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键、酰胺键及酯键，其水解速率为酯键＞酰胺键＞肽键。 中国药典2010版二部对于胰蛋白酶的效价测定采用专属性较高的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐作为底物。

测定法 取底物溶液 3.0ml与 0.001mol/L盐酸溶液 200l，混匀，作为空白。 另取供试品溶液200l，加底物溶液（恒温于25.0℃±0.5℃）3.0m1，立即计时，混匀，使比色池内的温度保持在25℃±0.5℃，照紫外-可见分光光度法，在253nm的波长处，每隔30秒钟读取吸光度，共5分钟。 以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，作图；每30秒钟吸光度的改变应恒定在0.0150.018之间，呈线性关系的时间不得少于3分钟。若不符合上述要求，应调整供试品溶液的浓度，再作测定。

P =（A1-A2）/（0.003TW） 式中 P为每1mg供试品中含胰蛋白酶的量（单位）； A1为直线上终止的吸光度； T为A1至A2读数的时间（分）； W为测定液中含供试品的量（mg）； 0.003为在上述条件下，吸光度每分钟改变0.003，即相当于1个胰蛋白酶单位。

三、生物检定法 生物检定法包括整体和离体测定。 生物检定法是利用药物对生物体或其离体器官组织等所起的药理作用来检定药物效价或生物活性的方法，用于无适当理化方法进行检定的药物。 生物检定法包括整体和离体测定。

基本概念 生物检定标准品 凡中国药典规定用生物检定的品种都有它的生物检定标准品（S）。 质反应 观察某一反应或反应的某一特定程度出现与否，只有出现与不出现两种情况，不能用量来表示个体的反应程度，只能用一组动物中出现正（或负）反应的百分率来表示，如死亡率、惊厥率，这类生物反应称为质反应。

基本概念 量反应 药物作用于生物体所引起的生物学反应随着药物剂量的增加而产生的量变，表现为剂量与药效存在着一定的数量关系，称为生物反应中的量反应。 等反应剂量比 生物检定是将供试品（T）和其生物检定标准品（S）在相同的实验条件下同时对生物体或其离体器官组织等的作用进行比较，通过对比，计算出它们的等反应剂量比值（R），以测得供试品（T）的效价PT。其中等反应剂量比值（R）是生物检定标准品（S）和供试品（T）等反应剂量（dS、dT）的比值，即R= dS/dT。

试剂：人凝血酶溶液 、人纤溶酶原溶液、 人纤维蛋白原溶液 示例：重组链激酶生物学活性测定法 依据链激酶和纤溶酶原形成的复合物能激活游离的纤溶酶原为有生物学活性的纤溶酶，纤溶酶能降解人纤维蛋白为可溶性的纤维蛋白片段，在纤维蛋白平板上出现透明的溶解圈，以此测定重组链激酶的生物学活性。 试剂：人凝血酶溶液 、人纤溶酶原溶液、 人纤维蛋白原溶液

测定法 取琼脂糖125mg，加生理氯化钠溶液23ml，煮沸使之溶胀，置5560℃水浴中平衡，加每1ml含100IU人凝血酶溶液14μl，人纤溶酶原溶液（每1ml含0.5mg）280μl，边加边摇匀，加每1ml含6mg人纤维蛋白原溶液2.2ml，不停的摇匀，浑浊后立即倒入直径8cm的平皿中，水平放置充分凝固后，4℃放置至少30分钟待用（应在两天内使用）。在含纤维蛋白平皿内打孔，孔径为2mm，在孔内分别加入供试品溶液和标准品溶液，每孔10μl，每个稀释度做两个孔，37℃湿盒水平放置24小时。 纵向和横向量取溶圈直径，各2次，取平均值。以标准品溶液各个稀释度的生物学活性的对数为横坐标，以溶圈直径的对数为纵坐标，按生物统计学分析结果，并求得线性回归方程，根据供试品的溶圈直径的对数求得供试品的生物学活性。

由于生物学差异的存在，生物检定法结果误差较大，重现性也较差，且操作繁琐、测定费时等，所以，目前生物检定法主要用于无适当理化方法或生化方法进行检定的生物制品药物，以弥补理化分析和生化分析的不足。 随着现代分析技术和生物检测技术的发展，生物制品的质量研究将会得到进一步的加强和提高，有效的理化分析与生化分析方法将越来越多地成为生物制品质量控制的首选方法。

小 结 第一节 概述 一、生物药物与生物制品 二、生物制品的种类和特点 第二节 鉴别试验 小 结 第一节 概述 一、生物药物与生物制品 二、生物制品的种类和特点 第二节 鉴别试验 一、理化鉴别法：化学反应法、紫外分光光度法、液相色谱法 二、生化鉴别法：酶法、电泳法 三、生物鉴别法 第三节 杂质检查 一、特殊杂质检查 二、安全性检查 第四节 含量（效价）测定 一、理化分析法：滴定法、光谱法、高效液相色谱法 二、生化分析法：电泳法、酶分析法 三、生物检定法

典型文献研读 1．梁成罡，毛 歆，沈 舒，等. 重组人促卵泡激素 (rhFSH)制剂的SDS-PAGE/Western blot鉴别方法研究. 药物分析杂志，2009,29（10）：1611-1614. 2．石劲敏，金 方. RP-HPLC法测定鼻用重组人胰岛素粉雾剂中的相关蛋白质. 中国医药工业杂志，2009,40（7）：532-535. 3. 李 晶，梁成罡，张 惠，等. 重组甘精胰岛素相关杂质的结构确认及质量分析. 中国药学杂志，2008，43（20）：1588-1592. 4. 李永红，张勇朝，袁力勇，等.重组 hPK-5质粒 DNA基因治疗制剂的质量标准研究.药物分析杂志，2008,28（5）：661-666. 5. 曾文珊，廖海明，杨仲元，等. 肽图分析在重组人甲状旁腺素 1-34产品质量控制中的应用. 中国药学杂志，2006，41（13）：1020-1022. 6．曾文珊，刘景晶，徐康森. 重组人甲状旁腺素 1-34分子量测定方法的研究. 药物生物技术，2006,13（4）：286-289. 7. 孔 婧，凤 姣，范 豪，等. 重组人甲状旁腺素 rh-PTH(1-34)结构类似物纯度的质量研究. 药物分析杂志，2010,30（5）：863-867.

练习思考题 研读中国药典2010版三部收载的生物制品注射用重组链激酶的质量标准