流式细胞术 在临床医学研究中的应用 崔巍 中国医学科学院 北京协和医院

流式细胞术（Flow Cytometry FCM ） 应用领域－广泛 免疫学 血液学 肿瘤学 细胞生物学 细胞遗传学 生物化学 检测手段 流式细胞仪 染色方法 免疫荧光标记 检测目标 单个细胞或颗粒 特点 在功能水平上对单细胞或其它生物粒子进行定量分析和分选； 同传统镜检相比，具有速度快、精密度高及准确性好等特点。

流式细胞仪工作原理

流式细胞仪的组成 鞘流系统 光学系统 电子系统 计算机系统 数据转换处理系统

散射光参数 前向小角度散射光（FSC） 侧向散射光（SSC） 1º~6º范围内 与细胞直径近似呈线性关系 与细胞大小有关 与光束-液流平面垂直（90º） 与细胞内部结构有关 根据FSC和SSC的特点可以把不同类型的细胞群加以区分， 外周血白细胞可分为淋巴细胞、单核细胞核中性粒细胞。

常见的荧光参数 参数 染料 激发光(nm) 发射光(nm) 应用 FL1 FITC（异硫青荧光素） 488 525 细胞抗原 FL2 PE（藻红蛋白） 575 FL3 PECY5/PerCP（藻红蛋白偶联物/多甲藻叶绿素蛋白） 488/532 667/678 FL4 APC（别藻青蛋白） 595/633 660 FL2/FL3 PI（碘化丙啶） 610 周期分析 细胞鉴定

荧光参数 荧光信号 由荧光素色团受激发后发生出的荧光 荧光检测 方向与SSC相同 双色镜和带通滤光片区分SSC和荧光 荧光波长比激发光的波长长 荧光信号的面积和宽度 面积用于DNA倍体测定 宽度用于区分双连体细胞

数据分析（1） 单参数分析 设门 多参数分析 第一步设门 直方图分析 二维散点图 二维等高线图 三维立体图 多参数组合分析 设门 在细胞分布图中确定一个范围或一片区域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析 第一步设门 前向散射光与侧向散射光散点图 CD45/侧向散射光散点图 白血病/淋巴瘤免疫分型 CD34计数 荧光信号脉冲面积/宽度散点图呈对角线样设门 细胞周期和倍体分析

数据分析（2） 直方图分析 二维散点图 二维等高线图 假三维立体图 三维立体图 多参数组合分析

分析和报告参数（1） 百分率 荧光强度 细胞有无的数量变化，指表达特异性抗原或分子的细胞占分析靶细胞群的百分率 淋巴细胞亚群计数、网织红细胞计数等 荧光强度 细胞抗原量的多少，指表达特异性抗原或分子的细胞其平均荧光强度，单位为道数 细胞周期和倍体分析时多采用512道数

分析和报告参数（2） DNA指数（DI） 多少个细胞/ul 用于DNA倍体分析 样本与人正常二倍体细胞的G0/G1峰的平均荧光道数的比值 用于绝对定量 外周血CD3 、CD4 和CD34的绝对定量 单平台法绝对定量借助内对照定量微球 双平台法借助其他检测手段得到绝对计数

流式细胞仪种类 临床型 功能相对较简单 固定光路，操作简单 适合临床细胞表面分型样品的检测和DNA分析等 科研型 操作复杂 功能复杂 临床型仪器的功能 科研功能：细胞内pH、膜电位、染色体核型分析等 分选功能

性能指标 精密度 灵敏度 准确度

精密度 通过对标准颗粒检测其散射光和荧光的分布范围来描述 以变异系数CV%表示，约为1-2%

灵敏度 由一系列标记有可溶性荧光染料等价分子数(MESF值)的微球组成（包括未标记荧光的空白微球） 微球所标记荧光物质的荧光强度等同于溶液中荧光染料的分子数 标记MESF值为1000的FITC微球其荧光强度等同于1000个FITC分子 根据系列微球检测结果的平均荧光强度通道数进行线性回归 最低检测浓度在回归曲线上与Y轴的交点即为灵敏度

准确度 准确度 同精密度和灵敏度相比不很重要 干扰因素过多，尤其是非线性问题 在样品中加入内标或生物活细胞，如鸡或鱼的红细胞

光谱重叠

光谱重叠补偿

流式细胞术的应用

诊断性指标 监测性指标 辅助性指标

临床诊断性指标 免疫表型分析: 白血病和淋巴瘤 CD55和CD59: 阵发性睡眠性血红蛋白尿 HLA-B27: 强直性脊柱炎 肺泡灌洗液(BALF)中T细胞亚群: 结节病和特发性肺间质纤维化 网织红细胞: 贫血 HbF: β珠蛋白生成障碍性贫血、某些异常血红蛋白病 血小板GPIIb/IIIa: 血小板无力症 血小板GPIb/IX: 巨大血小板综合症 PAIg: 特发性血小板减少性紫癜 CD40L: 高IgM血症的免疫陷缺病（XHIM）

白血病免疫表型分析

白血病和淋巴瘤免疫表型分析的临床意义 诊断和鉴别诊断白血病和淋巴瘤 参考范围 新参考范围的确定 ALL分型 鉴别AML与ALL 确定形态学不能区分的白血病类型及亚型 参考范围 淋系和髓系抗原超过20％为诊断标准 新参考范围的确定 CD45设门法

白血病的特异性标志 T淋巴细胞白血病 B淋巴细胞白血病 髓系白血病 NK淋巴细胞白血病 红白血病 巨核细胞白血病 系列非特异标志 cCD3/抗TCRαβ/抗TCRγδ/CD2/CD5/CD8/CD7/CD10 B淋巴细胞白血病 cCD79a/CD22/CD19/CD10/CD20 髓系白血病 cMPO/CD117/CD13/CD33/CD14/CD15/CD64 NK淋巴细胞白血病 CD16/CD56/CD57 红白血病 GlyA/CD36 巨核细胞白血病 CD41、CD42和CD61 系列非特异标志 CD34和HLA-DR

B-ALL特异性抗原的表型图谱

AML－M3的典型图谱

B-ALL+AML的表型图谱

白血病免疫表型分析的方法学评价 与形态学的关系 方法学优势 补充了形态学的不足 结合形态学分型，提高了对具有异质性和非同步性抗原表达紊乱的白血病细胞的鉴别能力 方法学优势 准确定位，去除了非靶细胞和碎片等干扰 高灵敏度 高速，计数细胞数提高50倍以上 多参数分析 减少人为误差

CD55和CD59计数

CD55和CD59计数的临床意义 帮助诊断PNH及鉴别其他贫血 健康人外周血中性粒细胞和红细胞膜 PNH患者 单一阳性峰 表达率>95% PNH患者 CD55和CD59的表达出现缺失 双峰/三峰/单一阴性峰 表达率低于95%

PNH诊断 - CD55和CD59的检测

CD59表达模式 Ⅰ型细胞 CD59表达完全阳性 Ⅱ型细胞 CD59表达部分阳性 其荧光强度处于Ⅰ型 及Ⅲ型之间 Ⅲ型细胞

淋巴细胞表面HLA-B27的表达情况可以帮助诊断强直性脊柱炎（AS） 正常人：7％ 强直性脊柱炎：96％ Reiter‘s综合征：70%～90% 银屑病性关节炎：50%～60% 急性前葡萄膜炎：40%～50% 溃疡性结肠炎伴关节病：5%～10%

CD3+T细胞HLA-B27检测的流式测定图

流式细胞术检测HLA-B27的方法学评价 与传统微量淋巴细胞毒方法相比 无须分离淋巴细胞 操作简单 检测速度快 结果稳定 可重复性高 灵敏度强 特异性高

BALF中T细胞亚群的检测 诊断和鉴别诊断结节病和IPF 常用标记 较免疫组化法 外周血变化不如BALF明显 T3细胞 结节病 T4细胞 肺结核和肿瘤不具有特征性变化 外周血变化不如BALF明显 常用标记 T3细胞 CD3+ T4细胞 CD3+CD4+CD8- T8细胞 CD3+CD4-CD8+ 较免疫组化法 准确快速 多参数分析

重要的实验室监测指标 外周血淋巴细胞亚群的计数 干细胞CD34计数 T3细胞的标记 T4细胞 T8细胞 调节性T细胞(Treg) B细胞 CD3+CD4+CD8- T8细胞 CD3+CD4-CD8+ 调节性T细胞(Treg) CD3+CD4+CD25highFoxp3+ B细胞 CD3-CD19+ NK细胞 CD3-CD16+56+。 干细胞CD34计数

外周血CD4/CD8/CD3计数流式测定图

T细胞亚群与HIV和SARS 帮助诊断和确定HIV感染的严重程度和药物疗效 帮助诊断SARS及监测病情 HIV感染 病情凶险 早期阶段 CD4+T细胞通常低于200个/mm3 病情凶险 CD4+T细胞低于40个/mm3时 帮助诊断SARS及监测病情 早期阶段 T4和T8细胞计数减低 病情好转 T4和T8细胞的数量也逐渐恢复正常

T细胞亚群与肿瘤和其他免疫相关性疾病 肿瘤病情的监测 其他免疫相关性疾病的病情监测 T细胞亚群 Treg细胞 其他病毒感染 免疫系统疾病 监测机体的免疫状态 Treg细胞 监测肿瘤发生发展和判断肿瘤预后 病情严重时Treg数量会明显增加 其他免疫相关性疾病的病情监测 其他病毒感染 免疫系统疾病 器官移植 放化疗 免疫抑制剂和免疫增强剂的使用

方法学评价 流式细胞术是检测淋巴细胞亚群的常规方法 不能采用单纯的CD4和CD8作为T细胞亚群检测的特异性标志 检测速度、灵敏度、特异性及重复性等均优于免疫荧光法，已完全取代了免疫荧光镜检技术 不能采用单纯的CD4和CD8作为T细胞亚群检测的特异性标志 CD4不仅仅表达于T辅助/诱导细胞，也弱表达于单核细胞 CD8不仅仅表达于T抑制/杀伤细胞，也表达于NK细胞 结合T总细胞抗原的标志（CD3）进行双色或三色分析，才能较为准确地分析T细胞亚群 结合白细胞抗原的标志（CD45）进行流式细胞术四色分析，结果将更为可靠

干/祖细胞CD34计数的临床意义 精确的造血干/祖细胞计数是确保移植成功的关键 正常人外周血 骨髓 动员后外周血 0.1%-0.3% 1%-3% 动员后外周血 CD34明显升高，通常高于1%。

其他有价值的指标

血小板GPIIb/IIIa结合蛋白和GMP140检测的 临床意义 用于判断血小板活化状态 正常人 血小板GPIIb/IIIa复合蛋白和GMP140不表达 当血栓性疾病、血栓前状态及手术或假体治疗等疾病引起血小板活化 GPIIb/IIIa复合蛋白和GMP140升高。

方法学评价 快速准确 常规检测方法 避免人为因素造成的体外血小板活化 需要注意抽血方式和离心速度 尽快送检(抽血后1小时内送检) 尽快处理标本

细胞周期和倍体分析 原理 碘化丙啶（PI）与细胞内核酸发生结合,细胞被PI染色后，使用RNA抑制剂将RNA消化，通过流式细胞术检测到的PI荧光强度,直接反映了细胞内DNA含量的多少。 根据PI荧光的强弱可以将具有不同DNA含量的细胞周期各时相G1/G0期（二倍体含量，2N）、S期（介于二倍体和四倍体之间）和G2/M期（四倍体含量，4N）区分开，并计算出各时相的百分率. 本实验为胞内染色，需要首先通过乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性，使PI进入细胞内，方可对细胞进行染色。

细胞周期和倍体分析的临床意义 判断肿瘤良恶性 判断组织细胞增殖能力 异倍体是恶性肿瘤的特异性指标 S期和G2/M期百分率 多倍体肿瘤 二倍体肿瘤 正常二倍体

细胞凋亡的检测 意义 检测方法 用于判断细胞死亡的方式 用于监测肿瘤或退行性疾病的疾病状态、疗效或预后 DNA含量分析 Caspase-3活性的检测 细胞膜结构改变的检测 DNA裂解点的检测 凋亡相关蛋白的检测

PI染色法用于细胞凋亡和周期分析 正常细胞的周期时相 细胞凋亡和周期

细胞膜结构改变的检测 原理 方法学评价 在凋亡细胞的形态学改变中，胞浆膜的改变是最早出现的 膜内侧磷脂酰丝胺酸（PS）从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin-V探针所标记 配合用于鉴定死活细胞的染料同时染色 7-氨基放线菌素D（7-AAD） PI 由于正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可标记上Annexin-V ，坏死和凋亡晚期细胞可被7-AAD/PI染色，因此可将各群细胞明显地区分开。 方法学评价 简单可靠 用于早期凋亡的检测 必须用活细胞 无法区分凋亡晚期细胞和坏死细胞

Annexin-V/7-AAD双染用于凋亡的早期检测

DNA裂解点的检测 原理 DNA裂解是细胞凋亡的最后一步，由于核酸内切酶活化，使得核小体内DNA断裂为50到300kb的片段，继而裂解为200bp的DNA碎片 由于碎片的产生暴露出多个3’-OH末端，利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT），能够催化外源性的dUTP或Brd-UTP连接到DNA碎片的3’-OH末端 以荧光物质标记抗dUTP或抗BrdUTP单抗，就可以用FCM检测到dUTP或Brd-UTP的数量，从而间接检测到凋亡过程中DNA碎片上所带的3’-OH末端 评价 灵敏度高，特异性好，目前已被广泛采用 同时与PI双染色，进一步检测细胞DNA含量

FITC-dUTP/PI双染色法用于凋亡的检测

凋亡相关蛋白的检测 常见的凋亡相关蛋白 P53 存在于胞浆或细胞核内 Bcl-2 Apo-1（Fas） 存在于细胞膜表面

突变型P53的检测 判断肿瘤的良恶性 正常组织细胞：P53不表达或弱表达 肿瘤的病变组织：P53表达增高

细胞因子IL-4/IFN-γ的检测

FCM在临床细菌学检验中的潜在应用 直接检出微生物：CBA 细菌鉴定 细菌毒素检测 细菌药敏试验 病原体的血清学诊断 幽门螺杆菌 布氏杆菌 沙门菌属 分枝杆菌属 支原体 细菌毒素检测 细菌药敏试验 病原体的血清学诊断

流式细胞仪的应用技术 细胞表型分子或抗原 细胞内分子或抗原 细胞外分子

细胞表面分子或抗原分析 单克隆抗体的出现和发展 分化抗体的鉴定和命名 提供重要的临床指标

FCM细胞表型分析

细胞内分子或抗原分析 细胞周期和倍体分析：70%冷乙醇 细胞因子检测：皂角素和蛋白移动抑制剂 髓性过氧化物（MPO）的检测 细胞内小分子表型的测定：如端粒长度 自发荧光分子的检测：如绿色荧光蛋白

细胞内抗原或分子的检测

体液中可溶性分子的检测－ 细胞微球试验(CBA) 原理 类似ELISA方法 使用一系列荧光微球捕捉样品中存在的多种可溶性蛋白，通过流式细胞仪进行快速和灵敏的定量检测 标本 血清、血浆、培养液、其他体液

CBA检测体液中细胞因子测定图 PerCP荧光强度 PE荧光强度

CBA 的优越性 能同时检测同一样本中多种可溶性蛋白 芯片式集成测定 标本量少，速度快 灵敏度高，重复性好 所有分析只需制备一组标准曲线 避免酶联反应产生的干扰影响

CBA的应用 可溶性细胞因子 酶类 补体 免疫球蛋白 IL-2,IL-4,IL-5,IL-10, IL-12，p70，TNF-,IFN- 活化的Caspase-3 补体 C3a,C4a,C5a 免疫球蛋白 IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgA,IgM和IgE的重链和轻链

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