HLA检测技术及其应用 河南省红十字血液中心 张伯伟 2012年8月 烟台
内容 血型 HLA概念 检测方法 HLA的应用 HLA与临床输血
血型种类及其遗传基础 血型:血液中各种成分的遗传(表现)多态性标志 血液成分:红细胞,白细胞,血小板,血清蛋白 遗传多态性表现:细胞表面,血浆中的各种特异性蛋白 多态性的遗传基础:基因(染色体上的核酸序列)
血型的发现 输血治疗的需要促使“血型”发现 15世纪后期开始输血 1900年Landsteiner发现人类红细胞ABO血型 1927年发现MN血型系统 1940年发现Rh血型 HLA1958年法国J.多赛发现
Landsteiner
血型的检测方法 免疫血液学方法:抗原、抗体检测方法 凝集实验:试管法、凝胶柱法、固相吸附、 流式技术 细胞生物学检测方法:混合淋巴细胞培养 分子生物学检测方法:血型基因检测 SSP、SSO、SBT
HLA概念 人类白细胞抗原,白细胞表面的一种糖蛋白,有非常复杂的生物学功能,非常复杂的多态性 广范存在于除白细胞表面的其他组织、体液中,与组织相容性有关,又称为组织相容性抗原
HLA概念:HLA分子结构 HLA-I类分子 HLA-II 类分子
HLA的生物学功能 参与内外抗原肽的处理,呈递. 自我识别的信号 某些病毒,细菌进入细胞的受体 与某些疾病的发病有关,如:B27与强直 自我识别的信号 某些病毒,细菌进入细胞的受体 与某些疾病的发病有关,如:B27与强直 性脊柱炎(AS)
HLA功能
(二)HLA复合体的遗传特征 1. 单元型遗传 2. 多态性现象 (1)复等位基因 (2)共显性表达 3. 连锁不平衡
HLA概念:HLA基因结构(6p21,3)
已经发现的HLA种类、数量
1. 存在于有核细胞(含血小板和网织红细胞) 表面。 HLA-Ⅰ类分子的分布 1. 存在于有核细胞(含血小板和网织红细胞) 表面。 淋巴细胞 > 肾、肝脏、心脏 > 神经组织、成熟的滋养细胞 2. 存在形式 (1)膜结合:有核细胞表面 (2)可溶性:存在于血清、初乳和尿液等体液中。
1. APC B细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞; HLA-Ⅱ类分子的分布 1. APC B细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞; 2. 其他 激活的T细胞,精子和血管内皮细胞。
HLA分型法原理及应用 血清学 细胞学 分子生物学 实验方法 补体介导的微量细胞毒试验 混合淋巴细胞培养法(MLC) 分子生物学技术 原理 单向法 双向法 比较供、受者编码HLA抗原基因的 DNA序列,判定供、受者间的相似程度。 主要应用 检测HLA-A、B、C抗原 检测DR抗原
HLA的检测方法 TERASAKI 发明的微量淋巴细胞毒实验: 用于HLA-I类抗原分型
HLA检测方法(分子生物学) 基于PCR技术的分型方法 PCR-SSP方法 操作简单、灵活 适合少量样本临床病例分型检测 通量较小
PCR-SSP方法
HLA检测方法(分子生物学) PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸探针) 杂交条方法 基因芯片方法 流式荧光微珠
芯片的工作原理 汇总每条探针数据得到所有样品的分型结果 将HLA基因的PCR产物固定在基片上 荧光标记的序列特异性探针杂交 探针 1 探针 2 探针 3 探针 n … ...... 杂交图谱 首先把HLA-A、B、DRB1三个位点的基因的PCR产物分别点到经化学修饰的基片表面,经过特殊处理使基因牢固附着在芯片的指定位置; 然后用荧光标记的序列特异性探针和芯片杂交,每条探针都是独立工作的,因此可以调整杂交条件使每条探针都能在最佳条件下杂交,这样可以避免反向杂交方式中由于所有探针必须在一个条件下进行杂交而出现的假阳性和假阴性问题; 在获得所有探针的杂交数据后,用自主研发的分型软件对数据进行分析就可以得到每个样品的HLA基因型。 汇总每条探针数据得到所有样品的分型结果 由计算机自动判读分型结果
PCR-SSO 流式微珠分型
SBT (DNA测序分型)
几种常用HLA分型方法比较 HLA分型方法 比较项目 PCR-SSP PCR-SSO杂交条 PCR-SSO微珠法 PCR-SSO芯片法 DNA测序方法 技术要求 低 低 较高 高 高 分 辨 率 中低 中低 中高 中高 高 检测通量 低 一般 较高 高 较高 使用设备 少 少 较多 多 较多 环境污染 EB致癌 轻微 轻微 轻微 轻 操作步骤 简单 简单 较复杂 复杂 较复杂 检测成本 低 低 较高 高 较高 适用范围 临床或小批量 临床、较大批量 中、大批量 大批量 临床、各种批量 应用情况 国内临床 国内临床 骨髓库 国家芯片中心 国外常规采用
HLA分型方法的发展趋势 高准确性:血清学-----分子生物学 高通量: SSP-------基因芯片、流式 高分辨: 低分辨-------中分辨--------高分辨 氨基酸残基配型:血型学-----基因------AA残基 (表位)
HLA的应用 免疫应答,T细胞分化 器官移植 与疾病关联 肿瘤关联 法医、个体识别、人类学研究
免疫应答
HLA与器官移植、临床输血 骨髓移植(造血干细胞移植) 肾移植 血小板输注 其他血液成分输血
HLA与疾病
HLA与肿瘤 恶性肿瘤细胞 HLA-Ⅰ类分子表达减少或缺乏,肿瘤细胞逃逸免疫监视。 IFN- 促进肿瘤细胞HLA-Ⅰ类分子表达 增 强CD8+CTL细胞的特异性杀伤。
法医、个体识别、人类学研究 HLA可以作为亲子鉴定的一个指标 刑侦 研究种族人群的迁徙
HLA与临床输血 溶血性输血反应,临床少见 发热反应,70%发热反应是由HLA抗体引起 血小板输注无效,首要因素是HLA抗体 GVHD TRALI
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