第十章 生物药物分析

基本要求 1．熟悉生物药物的范围、种类和特点。 2．掌握生物药物质量检验的基本程序与方法类型。 3．了解本类药物含量测定的方法。

事故案例 2008年5月22日至28日，有6名在南昌大学第二附属医院就医的患者，使用江西某制药公司生产的批号为20070514的静脉注射用人免疫球蛋白（pH4）后死亡。 江西省食品药品监督管理局采取紧急措施，对相关药品和资料进行封存，并责成该企业迅速召回该批次产品。 抽取样品送中国药品生物制品检定所检验，对相关药品和资料进行封存。

一、概述 化学药物 中 药 人类用于预防、诊断和治疗疾病的三大类药物 生物药物 生物药物的定义： 中 药 生物药物 人类用于预防、诊断和治疗疾病的三大类药物 生物药物的定义： 利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用化学、生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。

氨基酸、多肽、蛋白质、酶、多糖、核苷酸类等。 1. 生物药物的分类（Ⅰ） 生物药物按来源和生产方法可分为： 生化药物：从动物、植物及微生物等生物体中分离提取的，以及用生物-化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物等一类药物。 氨基酸、多肽、蛋白质、酶、多糖、核苷酸类等。 如丙氨酸、硫酸鱼精蛋白、氟尿嘧啶等。

人干扰素、人白细胞介素、促红细胞生成素、重组融合蛋白等 细菌类疫苗、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、生长因子、单克隆抗体等 1. 生物药物的分类（Ⅰ） 生物技术药物：应用基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等现代生物技术获得的药物。 生物制品：用微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料为原料制备的药物。 人干扰素、人白细胞介素、促红细胞生成素、重组融合蛋白等 细菌类疫苗、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、生长因子、单克隆抗体等

1. 生物药物的分类（Ⅱ） 按化学本质和化学特性可分为： 氨基酸及其衍生物类 蛋氨酸 谷氨酸 丙氨酸 氨基酸及其衍生物类 蛋氨酸 谷氨酸 丙氨酸 多肽和蛋白质类 催产素 血清白蛋白 胰岛素 酶和辅酶类 胃蛋白酶 门冬酰胺酶 凝血酶 核酸及其降解物和衍生物类 5-氟尿嘧啶 6-硫代嘌呤 多糖类 肝素 人参多糖 透明质酸钠 脂类 卵磷脂 胆红素 前列腺素系列（ PGE1、PGE2和PG12 ） 细胞生长因子类 生长素 白细胞介素 肿瘤坏死因子 生物制品类 疫苗

2. 生物药物的特点 蛋白质、核酸、多糖类、脂类等药物本身就直接取自体内，营养价值很高。 ① 生物药物的治疗针对性强，药理活性高。 细胞色素C用于治疗组织缺氧所引起的一系列疾病。 注射用的纯ATP可以直接供给机体能量。 ② 原料中的有效物质含量低，稳定性差 激素、酶在体内含量极低，且容易失活。生产过程中应低温、无菌。 ③ 毒副作用小，营养价值高。 蛋白质、核酸、多糖类、脂类等药物本身就直接取自体内，营养价值很高。

3. 生物药物分析的特点 ① 全过程的质量控制 此类药物对热、酸、碱、重金属以及pH较敏感，生物活性易发生变化，需对原材料、生产过程和最终产品进行质量控制。 ② 相对分子质量测定 除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激素等属化学结构明确的小分子化合物外，大部分为大分子物质，其分子量一般几千至几十万。对大分子的药物而言，即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。

3. 生物药物分析的特点 例 ③ 生物活性检查 多肽或蛋白质类药物在制备过程中容易失活。因此，需用生物检定法证实药物的生物活性。 ④ 安全性检查 生物药物多从生物材料中提取，有可能引入特殊杂质、病菌和毒素等污染物，因此需进行安全性检查，如热原和细菌内素检查、异常毒性试验、过敏性试验、无菌检查等。 尿激酶是由新鲜人尿中提取的一种蛋白水解酶，具有溶解血栓的作用，但由于人尿中也含有凝血活性物质，其含量过高会使血液呈高凝状态，易并发脑血栓，因此必须对其做限量检查。 例

3. 生物药物分析的特点 ⑤ 含量（效价）测定 对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定，以表明其活性成分含量的高低。 ⑥ 生化法确证结构 在此类药物中，由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以证实，往往还要用生化法如氨基酸序列、肽图分析等法加以证实。

生化药物质量控制的项目： 来源与种类 纯度 性状 干燥失重或水分 鉴别 炽灼残渣 氨基酸组分分析 生物活性 肽图 热源试验 糖含量 含量分析 二、生物药物的质量检定 生化药物质量控制的项目： 来源与种类 纯度 性状 干燥失重或水分 鉴别 炽灼残渣 氨基酸组分分析 生物活性 肽图 热源试验 糖含量 含量分析

二、生物药物的质量检定(Ⅰ) 1. 鉴别试验 利用化学法、物理法及生物学方法来确证生化药物的真伪。用标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。 1. 鉴别试验 利用化学法、物理法及生物学方法来确证生化药物的真伪。用标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。 ① 理化鉴别 —化学鉴别法 呈色反应、沉淀反应 —UV法 紫外特征吸收 —HPLC法 色谱图的保留时间和肽图谱

化学鉴别法 溶菌酶的鉴别采用呈色法，溶菌酶分子中的四个肽键上的氮原子能与铜离子络合生成有颜色的配位化合物。肽键越多，颜色越深。 溶菌酶： — CONH — + Cu2+ →络合显色 胃蛋白酶是具有高效、专一催化活性的特殊蛋白质，与酸、碱、重金属或有机溶剂作用引起蛋白质变性，生成沉淀。

光谱法——UV法和IR法 细胞色素C是以含铁卟啉为辅基的结合蛋白，在磷酸盐缓冲液（pH7.3）中，还原型在550、520、415nm处有最大吸收；氧化型在280、361、410与529nm处有最大吸收。 三磷酸盐腺苷二钠、门冬氨酸、色氨酸等氨基酸类药物采用IR鉴别，将供试品的IR图谱与对照品的IR图谱进行比对。

HPLC法 胰岛素的鉴别 采用HPLC法，固定相为ODS，柱温40℃，流动相为0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（pH3.0）-乙腈（73:27），检测波长214nm。 重组人生长激素 —供试品主峰的保留时间应与相应对照品的保留时间一致； —肽图谱供试品与对照品一致。 肽谱图是根据蛋白质分子量的大小和氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶，将蛋白质裂解成较小的片段，经分离检测形成特征性指纹图谱。肽谱图对每一种蛋白质来说都是特征和专一的。

1. 鉴别试验(Ⅱ) ② 生化鉴别 —酶法 利用酶对底物特异性的催化活力，作为酶类生物制品的鉴别。 尿激酶的鉴别:

1. 鉴别试验(Ⅱ) ② 生化鉴别 —电泳法 用于蛋白质、核苷酸类生物制品的鉴别。肝素鉴别： —免疫法 与肝素标准品对照，其移动位置一致。

1. 鉴别试验(Ⅲ) ③ 生物鉴别 利用生物体进行试验来鉴别药物，如采用小鼠血糖法鉴别胰岛素。 胰岛素的鉴别试验：取本品适量，用pH2.5~3.0的水配制成5U/ml的溶液，在20~30℃取体重为20~24g的小鼠5只，按0.25ml/20g体重的剂量皮下注射胰岛素溶液，2h内至少应有4只小鼠发生惊厥。立即给惊厥的小鼠腹腔10%葡萄糖注射液1ml，应能使惊厥停止。

2. 杂质检查 ①一般杂质检查 检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。 检查的原理及方法与化学药物杂质检查相同。

② 特殊杂质检查（Ⅰ） 许多药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。 如脏器生化药物是从动物的组织、腺体、分泌物等提取的药物。 脑磷脂、脑活素来自于大脑 辅酶A来自于肝脏 胃蛋白酶来自于胃 硫酸软骨素来自于骨 尿激酶来自于尿 组氨酸、赖氨酸来自于血 人工牛黄来自于胆汁 胰岛素来自于胰腺等。

② 特殊杂质检查（Ⅱ） 原料药的纯度分析 生产过程中杂质检查 贮存过程中杂质检查 胰岛素是一种分子量较小的激素蛋白，必须从动物的胰脏中提取，在胰岛素的制备过程中引入的有关蛋白和大分子蛋白需加以控制，对于有关蛋白的检查，ChP采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，BP采用HPLC法。大分子蛋白的检查，ChP和BP均采用分子排阻色谱法。 例

3. 安全性检查(Ⅰ) 热原和细菌内毒素检查（家兔法、鲎试剂） 无菌检查 用于要求无菌的生物制品及相关辅料 异常毒性试验 无菌检查 用于要求无菌的生物制品及相关辅料 异常毒性试验 用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点。 小鼠试验 豚鼠试验

3. 安全性检查(Ⅱ) 过敏试验（检查异性蛋白） 药物中若夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引起病人多种过敏反应，轻者皮肤出现红斑或丘疹，严重者可出现窒息、血管神经性水肿、血压下降，甚至休克和死亡。 细胞色素C溶液的过敏试验 依药典方法将一定量的供试品溶液注射给豚鼠，观察期内不得出现过敏性反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种或以上者，或有啰音、抽搐、虚脱或死亡等现象之一者，应判为阳性。 例

3. 安全性检查(Ⅲ) 降压物质检查法 包括组胺、类组胺在内的能导致血压降低的物质。 来源：用动物脏器或组织为原料制备生化药物，正常组织内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胶类物质。 方法：将组胺对照品稀释液与供试品稀释液静脉注入麻醉猫（狗），比较两者引起的血压下降程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定。

3.含量（效价）测定 定量表征生物药物的方法 —用百分含量表示，适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物。 —用生物效价或酶活力单位表示，适用于酶类和蛋白质类等药物的测定。 常用的含量（效价）测定方法 理化分析法、生化测定法、生物检定法

①理化分析法 化学分析法 —重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。 （1）提取法 （2）挥发法 （3）沉淀法 用适宜的溶剂提取样品中的待测成分，再蒸去溶剂进行测定。 利用被测组分具有挥发性，或将其转化为挥发性物质来进行测定。 利用沉淀反应，将被测组分转化为沉淀分离出来，然后经过滤、烘干或炽灼，最后称重计算其含量。

①理化分析法 —滴定分析法：根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生中和、氧化还原或络合反应等进行测定。 利用氨基酸类药物分子中氨基的碱性，可采用非水溶液滴定法测定含量，如色氨酸、苏氨酸、组氨酸、L-门冬氨酸、L-丙氨酸等。 谷氨酸利用羧基的酸性采用中和滴定法测定。 甘露醇和山梨醇均采用碘量法测定含量。

①理化分析法（Ⅱ） 电化学分析法

①理化分析法（Ⅲ） 光谱分析法 —比色法：样品与显色剂可发生颜色反应，依颜色反应的强度测定含量。如蛋白质的含量测定，可利用蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应，而进行定量测定。 —UV法：样品或转化后的产物在某一波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测定。如蛋白质在280nm左右有最大吸收 。 —荧光分光光度法：根据物质被UV光照射后产生的荧光强度进行定量测定。

①理化分析法（Ⅳ） 色谱分析法 —HPLC法 （1）RP-HPLC法：适用于肽类、氨基酸、蛋白质和多糖的测定，如生白能的含量测定。 固定相：C8、C18烷基硅烷键合相 流动相：甲醇-水、乙腈-水（甲醇）、乙腈-缓冲液 检测器：紫外、荧光或电化学检测器 （2）高效离子交换色谱法（HPGEC） （3）高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）

①理化分析法 —高效毛细管电泳法（HPCE） 在生物药物的分离分析中应用广泛。如氨基酸的分离、蛋白质的分离及其分子量的测定、DNA合成中产物纯度的测定等。

②生化测定法 酶法 酶活力测定法：以酶为分析对象，测定样品中某种酶的活力或活性，并用活性单位（IU）和比活性(1mg酶的活性单位)表示 。 酶分析法：以酶为分析工具或分析试剂，测定样品中酶以外的其它物质的含量。 类型

一）酶活力测定法 定义： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度─可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。 酶活力测定的目的就是要通过酶反应速率的测定，求得酶的浓度或含量。

一）酶活力测定法 测定方法 取样测定法：将酶与底物混合反应一定时间后，取出一定量反应液停止反应，定量测定底物减少或产物生成的量，求得单位时间内酶促反应的变化量。如药典收载胃蛋白酶的效价测定 连续测定法：将酶和底物混合后隔一定时间，间断地或连续地测定反应的连续变化。药典中胰蛋白酶的效价测定

二）酶分析法 总变量分析法（平衡法或终点法）： 根据被测物质（底物）的性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用，在反应完成后，借助理化方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度。

二）酶分析法 2. 动力学分析法（反应速率法）： 2. 动力学分析法（反应速率法）： 通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用。则酶的反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，通过测定酶反应速度即可求出它们的浓度。

③生物检定法 生物检定法是利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 应用 1、药物的效价：适用于测定一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物。如洋地黄、胰岛素、肝素及各种抗生素。

③生物检定法 2、微量生理活性物质的测定：一些神经介质，激素等微量生理活性物质，由于其很强的生理活性，在体内浓度很低，加上体液中各种物质的干扰，很难用理化方法测定。而不少活性物质的生物测定法因灵敏度高、专一性强，对供试品稍作处理即可直接测定。 3、体内微量生理活性物质的测定 基因工程药物质量控制（略）

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