细胞工程 Cell Engineering 细胞工程 细胞工程 细胞工程 细胞工程 细胞工程 细胞工程 Cell Engineering Cell Engineering Cell Engineering Cell Engineering
知识模块3：细胞工程实验室组成 及基本技术（第三章） 知识模块3：细胞工程实验室组成 及基本技术（第三章） 知识点1：实验室设计及仪器设备 知识点2：基本操作技术 知识点3：培养基及其配制 知识点4：生物安全实验室
第二部分 基本操作技术 基本操作技术主要是围绕无菌操作技术展开的一系列操作技能，内容主要包括： 一．洗涤技术 二．灭菌、消毒技术 三、无菌操作技术
一、 洗涤技术 、洗涤目的：去除杂物，降低带菌量 、根据洗涤对象的不同，主要分为： 器皿洗涤（包括玻璃、塑料、搪瓷、 不锈钢器皿） 培养材料洗涤
（一）器皿洗涤 根据洗涤对象的具体情况可分为以下三种： 常规洗涤 微生物大量污染的洗涤 特殊洗涤
常规洗涤 △ 自来水洗去油渍、霉菌等脏物； △ 温肥皂水中浸泡一定时间后用刷子刷净； △自来水冲洗干净，至瓶壁不挂水珠为止； △ 蒸馏水淋洗内外壁 △ 将玻璃器皿倒置：晾干或烘干（50～75℃） △ 放入除尘柜中备用
清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或洁消精浸泡过夜 玻璃器材的清洗处理方法 浸泡 刷洗 清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或洁消精浸泡过夜 自来水冲10次 单蒸水洗2次 晾干备用 培养瓶再用三蒸水浸泡过夜 晾干 包装 灭菌 备用
塑料器材的清洗处理方法 浸泡 刷洗 用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜 （单用或交叉处理） 水洗10次 单蒸水2次 三蒸水浸泡过夜 晾干 紫外线或辐射灭菌备用
橡皮器材的清洗处理方法 5%NaOH煮10 ～20 min 水洗 4%盐酸煮10 ～20 min 水洗8~10次 浸泡 刷洗 5%NaOH煮10 ～20 min 水洗 4%盐酸煮10 ～20 min 水洗8~10次 单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用
金属器材的清洗处理方法 金属器材的清洗处理方法 脱脂棉擦去表面的油脂 洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠煮沸15 min 水洗 95%酒精纱布擦干 包装灭菌
胶塞的清洗 ◆ 新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理 胶塞的常规清洗处理方法 ◆ 常规清洗方法： 水中浸泡 二、 胶塞的清洗 ◆ 新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理 胶塞的常规清洗处理方法 ◆ 常规清洗方法： 水中浸泡 2%NaOH煮沸10-20min 自来水冲洗 1%盐酸浸泡30min 自来水冲洗 蒸馏水清2-3次 晾干
特殊洗涤（如沾有蛋白质类物质或其它有机物时) 微生物大量污染的洗涤 △ 微生物污染器皿加压灭菌后再洗涤 特殊洗涤（如沾有蛋白质类物质或其它有机物时) △ 经过常规洗涤未过蒸馏水的器具，浸泡入洗液（铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成）中数分至数小时； △ 回收洗液，器具先用自来水洗净，蒸馏水淋洗，烘干（75℃）
（二）、试验材料的清洗 清洗目的：来自自然界的试验材料，包括来自土壤中的幼茎、磷茎，滋生着各种微生物，尤其是细菌的芽孢和真菌的孢子，一旦与培养基接触，就会很快的繁殖起来，造成培养基和培养材料的污染。 清洗方法：先用自来水冲洗5min，然后用中性洗涤剂清洗，注意勿损伤试验材料。再用自来水流水冲洗半小时，用于下一步的药剂灭菌。
二、灭菌、消毒技术（无菌技术） 重要概念 1.消毒 杀死含芽胞的细菌或非病原微生物 2.灭菌 杀死物体上所有微生物的方法。 消毒与灭菌 重要概念 杀死物体上病原微生物的方法；并不一定能 杀死含芽胞的细菌或非病原微生物 杀死物体上所有微生物的方法。 防止或抑制微生物生长繁殖的方法。 不存在活的微生物。 1.消毒 2.灭菌 3.防腐 4.无菌 5.无菌操作 防止微生物进入机体或局部环境的操作技术。
无菌观念 （一）关于有菌和无菌的概念 有菌的范畴： 凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。
无菌的范畴： 高压高温处理（工具、器皿、培养基等） 物理或化学处理； 火烤后的物体； 健康的动植物不与内外部表面接触的组织 内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但 不会影响培养，也不会污染）
（二）灭菌、消毒技术作用和意义 离体培养中，凡用于培养和无菌操作的房间、器具、培养瓶、培养基，培养材料和操作者的衣物和手都应随时进行灭菌，以确保不受杂菌污染，否则，由于杂菌的生长繁殖速度一般都比培养的细胞组织快得多，最终将把组织全部杀死，这些污染微生物还可能排泄对细胞组织有毒的代谢废物，因此在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必须的。
（三）灭菌、消毒种类 物理方法： 物理灭菌：高温高压灭菌（干热/湿热）、烘烤或灼烧灭菌、射线处理、超声波等 物理除菌：过滤（0.1微米、0.22微米、0.45微米、0.8微米等） 、离心沉淀等； 化学方法：使用灭菌剂，如薰蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧化氢）
常用的灭菌方法 物理方法 化学方法 干热灭菌(烘烧和灼烧) 甲醛(福尔马林) 过氧化氢 湿热灭菌(常压或高压蒸煮) 高锰酸钾 来苏儿 射线处理(紫外线、超声波、微波) 漂白粉 过滤除菌 次氯酸钠 升汞(氯化汞) 大量无菌水冲洗 酒精 ……
物理法灭菌 火焰灭菌 酒精灯火焰 射线灭菌 钴60（60Co ），用于牛血清、塑料制品 紫外线灭菌 空气、操作台表面 。紫外灯距地面2.5米 物理法灭菌 火焰灭菌 酒精灯火焰 射线灭菌 钴60（60Co ），用于牛血清、塑料制品 紫外线灭菌 空气、操作台表面 。紫外灯距地面2.5米 干热灭菌 玻璃器皿 160 度保持90120min 湿热灭菌 布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿、某些液 体物品等 滤过除菌 培养用液 0.22 µm微孔滤膜
酒精灯火焰灼烧灭菌
紫外线 适用于无菌室、超净工作台的消毒。 紫外线的波长为200~300nm，最强是在254 nm，6~15平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m以下，湿度45%~60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。 优点：消毒效果好，面种大，使用方便。 缺点：产生臭氧、气味难闻。
干热灭菌 适于用玻璃器皿的消毒，160~170℃，90~120min或 180℃45~60min。 优点：使用简便，消毒后的物品干燥，易于保存。 缺点：干热传导较慢，需较长时间。
湿热灭菌 用于玻璃制品、滤器、橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品的有效灭菌压力和时间不同，如：培养液、橡胶制品、塑料器皿等[68kPa (115℃), 10min]； 布类、玻璃制品、金属器械等[103kPa (121℃), 15min]。 优点：消毒效果好，时间短。 缺点：需专人监管，不能离开人，应随时注意压力的变化。以免发生意外（手提式灭菌器）。
滤过除菌 此法适用于消毒大多数细胞培养用液，如培养液、消化液、Hanks液、血清以及其他不能用高压蒸汽消毒的液体。用孔径0.22微米微孔滤膜可除去细菌和霉菌等。
过滤除菌装置
煮沸消毒 金属器械和胶塞在水中煮20~30min，趁热倾去水分即可使用。紧急情况时使用。
化学法灭菌 化学灭菌剂灭菌 70％（或75％）酒精 0.1-1%Hgcl2(升汞) 饱和的漂白粉溶液 2%次氯酸钠 0.5过氧乙酸 化学法灭菌 化学灭菌剂灭菌 70％（或75％）酒精 0.1-1%Hgcl2(升汞) 饱和的漂白粉溶液 2%次氯酸钠 0.5过氧乙酸 来苏尔（煤酚皂） 0.1%新洁尔灭 等 抗生素消毒：青霉素类、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、利福平等 气体熏蒸：37％甲醛加热沸腾后，加适量高锰酸钾，关门窗1～3天
化学灭菌剂 化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制品进行消毒灭菌的方法。实验室地面、桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。 2%煤酚皂溶液（来苏尔） 0.25%新洁尔灭 1%升汞 3~5%甲醛溶液 75%酒精。
化学消毒剂 消毒剂类别 名称 浓度(%) 用途 重金属盐 红汞 2 皮肤、粘膜、小创面消毒 硫柳汞 0.01 生物制品防腐 氧化剂 高锰酸钾 0.1 皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒 过氧化氢 3 皮肤、粘膜、创伤消毒 过氧乙酸 0.2～0.5 塑料、玻璃、人造纤维消毒 卤素类 碘液 2.5 皮肤消毒 醇类 乙醇 70～75 皮肤、体温计消毒 酚类 石炭酸 3～5 地面、器皿表面和排泄物消毒 来苏 同上、也常用于手及皮肤消毒 表面活性剂 新洁尔灭 手术器械消毒 酸碱类 生石灰 1:4～1:8 排泄物、地面消毒 染料 龙胆紫 2～4 表浅创伤消毒
几种常用消毒剂的效果比较 次氯酸钙 10 5～30 好 易 次氯酸钠 2～5 5～30 好 易 新洁尔灭 10～20 5～30 好 易 消毒剂 使用浓度(％) 消毒时间(分) 效果 残液去除难易 次氯酸钙 10 5～30 好 易 次氯酸钠 2～5 5～30 好 易 新洁尔灭 10～20 5～30 好 易 氯化汞 0.1～1 2～10 最好 最难 过氧化氢 10～12 5～15 较好 最易 抗菌素 4～50mg/L 30～60 较好 较难
附：常用消毒剂的性质 70～75％酒精： 具有较强的穿透力和杀菌力，常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭菌的双重作用，但不能彻底灭菌，必须结合其他药剂灭菌。一般处理时间为5～30s。为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1％的酸或碱，因为H+和OH-可改变细胞膜带电荷的性质而使透性增加，提高杀菌的效果
升汞（HgCl2）： 剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2＋与带负电荷的蛋白质结合，使菌体酶蛋白变性失活。使用浓度0.1～0.2％，一般浸泡处理6～12min就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌，灭菌效果极好。但用升汞灭菌的外植体材料须用无菌水反复多次冲洗，才能洗去残留的汞，否则会对外植体产生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于5次。由于升汞的毒性剧烈，使用中务必注意安全。
升汞废物的处理 升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上；二则使用后要进行处理，不能直接倒入下水道。 升汞处理方法： 絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止） 升汞＋Na2S ＋FeSO4（中和过多的Na2S ）
次氯酸钠（NaClO）： 用市售的“安替福民”配制2～10％的NaClO，灭菌时间5～30min，无菌水冲洗4～5次。由于它分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易于除去，无残留，既有较强的杀菌力，又对植物无害，是常用的杀菌剂。
过氧化氢（双氧水）： 常用6～12％的溶液处理外植体材料，灭菌效果较好，由于该药剂在外植体表面容易除去，又不会损伤外植体，通常用于叶片材料的灭菌。
新洁尔灭： 一种广谱的表面活性灭菌剂，它对绝大多数植物外植体伤害很小，灭菌效果很好。通常使用1：200稀释液，处理30min或更长。
在用上述药剂进行材料的灭菌处理时，为了使杀菌剂湿润整个组织，有时还需在药液中加入润湿剂。如加入数滴或0 在用上述药剂进行材料的灭菌处理时，为了使杀菌剂湿润整个组织，有时还需在药液中加入润湿剂。如加入数滴或0.1％的吐温（Tween）80或吐温20，或者用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂充分接触外植体，以利于彻底灭菌。
熏蒸消毒 适用于无菌室等房间的消毒。高锰酸钾5~7.5g，加甲醛（40%）10~15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24小时，致少4小时以上。
三、无菌操作技术 • 操作区消毒 • 洗手和着装 • 火焰消毒 ◆无菌操作 成功或失败的首要条件 ◆操作前准备 操作卡片 用品置于场地，然后消毒 • 操作区消毒 • 洗手和着装 • 火焰消毒 ◆保持操作的无菌性
• 动作准确敏捷 • 不用手触及已消毒物品 • 操作面布局合理 • 操作保持一定顺序 • 培养用瓶和吸管的放置 • 防止各种用液的交叉污染 • 不向操作区讲话或咳嗽
无菌操作要求及注意事项 环境： 1.无菌操作应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 2.工作台面及操作室环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的进行洁净度验证。
无菌操作要求及注意事项 3.无菌操作室操作前要用0.1%的新洁尔灭或来苏水清洁剂，清洁―次(抹布要专用).紫外线照射消毒30-50min；
无菌操作操作步骤 操作 1.实验器具和材料的准备 在开试验前要制定好实验计划和操作程序。 有关数据的计算要事先做好。 准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。 这可以避免开始实验后，因物品不全，往返拿取而增加污染机会。
无菌操作操作步骤 2.超净工作台的灭菌准备 用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。
无菌操作操作步骤 3.操作工具灭菌准备 用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。
无菌操作操作步骤 4.外植体的灭菌处理 取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。 5. 接种 打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。 6.下轮操作准备 用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。
注意事项 进行操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换 为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央 工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会 吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染 工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染 手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉
接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中 正 确 错 误
整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速 正 确 错 误
接种过程中尽可能达到悬空要求 防止操作带来的污染 正 确 错 误
接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 正 确 错 误
瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口 正 确 错 误
接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生
种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足 正 确 错 误
接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中 正 确 错 误
细胞培养室中下列物品该如何消毒灭菌？ • 玻璃培养瓶，移液管， 试管等玻璃器皿？ • 超净工作台台面？ • 金属手术器械？ • 玻璃培养瓶，移液管， 试管等玻璃器皿？ • 超净工作台台面？ • 金属手术器械？ • 不耐热的液体培养基和胰蛋白酶等 ？ • 橡胶塞和塑料瓶盖等？ • 细胞培养室？ • 操作人员的手部？ • 实验室桌面、地面等？
无菌操作要求及注意事项 人员： 无菌试验操作进入万级操作间时，操作人员必须着装整齐，穿好已灭菌的三更服装。 需带两层口罩，一层是白纱布，最后一层随三更服已灭菌的口罩。 方可进入无菌室进行操作 。
无菌操作要求及注意事项 在操作中为最大可能的保证无菌。 每一项工作都必须做到有条不紊。