主讲：广东教育学院生物系 吴映明 E-mail: wuym88@163.com 微生物实验技术（精选） 主讲：广东教育学院生物系 吴映明 E-mail: wuym88@163.com.

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1 主讲：广东教育学院生物系 吴映明 E-mail: wuym88@163.com
微生物实验技术（精选） 主讲：广东教育学院生物系 吴映明

2 主要内容： 一、细菌培养基的制备（简易培养基） 二、使用家用压力锅灭菌的方法 三、无菌操作室及无菌操作技术 四、微生物实验技术操作规范示例

3 一、细菌培养基的制备 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基 ：牛肉膏 3g , 蛋白胨 10g，NaCl 5g, 琼脂 15~20g，水 1000mL，pH7.4~7.6 简易培养基配方： 1.凉粉牛奶培养基配方：         凉粉    50g        纯牛奶    100g                水        1000mL    pH7.4~ 牛奶(豆浆)琼脂培养基配方：         纯牛奶(或豆浆)   100mL     NaCl( 或食盐)   0.5g         琼脂     16g      水   1000mL     pH 马蹄粉牛奶培养基： 马蹄粉 50g        纯牛奶    100g         水        1000mL      pH7.4~7.6

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5 培养基制备的一般过程： 1．称量和溶化 2.调节pH值：1N的盐酸或1N的氢氧化钠溶液调节酸碱度 3.过滤：用双层纱布。没特殊要求可不过滤。
4.分装：分装于三角瓶的，不超过其容量的一半；制备斜面培养基的，分装于试管不超过其管长的1/5。 5.加棉塞并包扎：方法见后示范 6.灭菌：121℃维持20—30分钟 7. 摆斜面或倒平板培养（将已灭菌的培养基倒入已灭菌的培养皿中）

6 二、使用家用压力锅灭菌的方法 常用高压蒸汽灭菌锅 家用压力锅

7 1. 加水约1000mL，往锅内放一块纱布

8 2.放入待灭菌物品

9 3.按要求盖严锅盖 4.加热至沸腾后，排净锅内空气（约3分锅）

10 5 . 盖上限压阀 6.待锅内压强达到限压临界时，开始计时，维持30分钟

11 7.打开限压阀，待锅内没蒸汽喷出后取出灭菌物品
已灭菌的培养基 已接种的平板培养基

12 三、无菌操作室及无菌操作技术 （一）无菌操作室的设计要求 1.标准接种室设计要求：
（1）接种室6~8平方米，缓冲间2~3平方米，高度2~2.2米 （2）使用推拉门，室内结构要有利于清洁和消毒处理 （3）接种室和缓冲间要安装紫外灯及日光灯各一盏

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15 单人接种箱 双人接种箱

16 （二）无菌操作室（或接种箱）的消毒 （1）薰蒸法：每立方米空间用10毫升福尔马林（甲醛36%左右的水溶液），加入5克高锰酸钾，密闭薰蒸24小时； 甲醛挥发气穿透力极强，甲醛能与微生物细胞蛋白质的氨基结合而使之变性，对人的皮肤、眼和呼吸道有毒害和刺激作用。 残留在室内的甲醛可用氨水吸收，氨与空气中的甲醛结合，形成白色无臭粉末（乌洛托品），对人体无毒，氨的用量为甲醛的一半。

17 薰蒸消毒过程

18 （2）照射法：用紫外线杀菌灯照射半小时，空气中的细菌数可下降96%；
紫外线可导致细胞内核酸和酶发生光化学变化而使细胞死亡；另外，紫外线还可使空气中氧气产生臭氧，臭氧也具有杀菌作用。 紫外线灯管有效作用距离为1.5~2米，以1.2米最好，因此应将紫外线灯安装在距工作台上方1.2米处。它对物体的穿力很差。 经紫外线照射的菌体，若再暴露在可见光下，受损伤的一部分细胞可恢复其活力，称光复活。故用紫外线消毒时，应保持室内无可见光，关闭紫外线灯后不要马上开启日光灯

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20 （3）喷雾法：用化学消毒剂对接种室（箱）进行喷雾消毒。常用消毒剂如下：
石炭酸（又名苯酚）：有特殊气味（酚臭）和腐蚀性，对皮肤有刺激性。使用浓度为5%。 煤酚皂溶液（亦称来苏尔）：为50%煤酚的肥皂溶液。使用浓度为2~3%（有效浓度）。 新洁尔灭（十二烷基甲基苯甲基溴化铵）：浅黄色胶体状，具有芳香气味。原液浓度为5%，使用浓度为0.25%。 酒精：70~75%消毒效果最好。