Molecular Pathology introduction 分子病理学导论 汕大医学院病理教研室 苏　敏

Pathology What are the specific changes in function and structure that characterize each disease? Level A. Naked eye level: gross changes in diseased organs. Level B. Light microscopic level: in histological and cytological level. Level C. Electron-microscopic(EM) level: in the ultrastructure (cellular organelles). Level D. Molecular level: inspect aberrant in DNA, RNA, and protein.

第一节 绪言 分子病理学(molecular pathology)是在蛋白质和核酸水平，应用分子生物学技术研究疾病发生发展过程中的一个病理学分支学科。 通常人们将所有的生物分子分为两类: 1. 水、无机盐、碳水化合物和寡核苷酸等的小分子，分子量一般小于500D; 2. 生物大分子，体内最重要的生物大分子即蛋白质和核酸，它们是生命体结构和功能的核心物质。

分子病理学的核心内容是通过对蛋白质和核酸等生物大分子的结构、功能及其相互作用等规律的研究来阐明生命的分子基础，从而探索生命和疾病乃至生与死的奥秘。 就病理学的学科体系而言，凡是传统病理学涉及的领域，如疾病的病因、发病机制、病理变化、转归及相应的功能代谢变化，都是分子病理学的研究内容和对象。

第二节 细胞核、遗传物质分子病理学 一、细胞核与遗传物质 （一）细胞核 有核膜包围的细胞核是真核细胞区别于原核细胞的最主要特征，在光镜下细胞核中可见核仁结构。 由真核细胞组成的生物称为真核生物，包括单细胞生物（如酵母）、原生生物、动植物及人类等。

（二）细胞核与遗传信息储存结构 真核细胞与原核细胞在结构上存在很大差异。真核细胞与原核细胞在基因组（genome）组成上的差异主要有三个方面： 真核细胞含有更多的DNA，DNA是遗传信息的携带者，所以，真核细胞比原核细胞蕴藏着更多的遗传信息。此外，真核细胞的DNA不成环状，而呈线状并被包装成高度凝集的染色质结构； 2. 真核细胞的细胞器也含DNA，在线粒体中含有少量的DNA,可编码线粒体tRNA、rRNA和组成线粒体的少数蛋白；

3.原核细胞的mRNA转录与蛋白质翻译同时进行，即边转录边翻译，无需对mRNA进行加工，但真核细胞的mRNA在合成之后，必须在细胞核内经过剪接加工，然后运输到细胞浆中翻译成蛋白，即DNA在细胞核中，储存遗传信息的DNA是以与蛋白质结合形式存在，并被包装成为高度有序的染色质结构。 4. 转录与翻译分开进行。

(引自WWW.DXY.cn)

(引自WWW.DXY.cn)

二、 细胞核与疾病 （一）基因病 人类疾病的发生发展直接和间接地与基因密切相关。因此，可以认为人类的疾病都是基因病。正因为如此，人们一直不遗余力地寻找某基因和某疾病的对应关系。

基因病可分为三大类： 1.单基因病：由单个基因缺陷引发。常遵循经典孟德尔遗传定律：一些表现为常染色体显性遗传，如短指、马凡氏征、眼睑下垂征等。有些表现为常染色体隐性遗传，如白化病、先天聋哑等。还有一些致病基因位于性染色体上，呈现性连锁遗传，如红绿色盲。

马凡氏征

白化病

2．多基因病：涉及多个基因缺损。缺损基因之间可有相互作用，也可能有主次之分，也可能受环境的影响,并常出现家族倾向。 属于复杂遗传病（complex genetic disease） 如糖尿病、心血管疾病、各种肿瘤等。 与简单的单基因疾病相比,复杂性状疾病的形成,是许多微效基因的加和作用。在这些不同基因构成的遗传背景中,可能存在主要易感性基因(majorgene)。 除此之外,基因是否发挥作用和基因作用的最终结果(表型),还要受环境因素的制约。

（1）定位克隆疾病易感性基因。 因此,如果要阐明这类疾病的发病机制,需要解决两个问题: 绝大多数疾病的发生是众多微效的、低外显率的易感基因相互作用以及它们与环境因素相互作用的综合结果。 鉴定疾病易感基因，目前有关的主要理论为：每种疾病都存在相对应的一组变异等位基因（包括多态性），而且这些基因变异在人类祖先或某些人群祖先就发生了。因此，采用高通量技术，结合遗传分析方法，有可能从疾病患者基因组中一个个地找出相应的变异等位基因。

疾病相关基因定位和克隆的常用方法 ①定位克隆 ②候选基因关联分析。 以序列标记（突变、微卫星、SNP等）为筛查标记，根据疾病患者组与匹配对照组出现频率的显著性差异，从候选基因中筛出易感基因。这是目前最常用的方法。

疾病相关基因定位和克隆的常用方法 单倍型（haplotype）关联分析 单倍型（haplotype）关联分析。据新近单倍型作图（haplotype mapping）结果表明，人类基因组中含有12万个单倍型域（haplotype block），每个域平均长度为25kb,加起来正好覆盖整个基因组，而每个域最多横跨1个目标基因。因此，可以单倍型域为靶标，进行全基因组扫描，寻找与疾病易感性相关的单倍型域，找到了单倍型域，也就找到了相应的易感基因。

人类基因组单体型图（Haplotype map, 以下简称HapMap）计划是人类基因组研究领域的第二个重大战略目标。 其主要内容是对亚、非、欧裔全基因组中DNA序列上的多态位点进行测定和分析，由此构建出整合了人类遗传多态信息的每条染色体的“单体型图”。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的DNA序列多态性,频率大于1%。 SNPs在人类基因组中广泛存在,并通常以二等位基因的形式出现,便于进行大规模和高通量分析,因此是继限制性酶切长度多态性(RFLP)和微卫星之后的第三代遗传标记。

SNP最大程度地代表了不同个体之间的遗传差异，因而成为研究复杂疾病、药物敏感性及人类进化的重要标记。至今在人类基因组中已有五百多万个SNP位点被确定。 由此，在人类基因组计划协作组基础上建立的“HapMap计划”国际协作组提出了人类基因组研究的第二个战略任务，即再次以多国分担合作的形式，共同构建整合了人类全基因组遗传与变异信息的单体型图。

HapMap的科学基础是染色体上的SNP的“板块”（block）结构。 SNPs在一段染色体上是成组遗传的，在DNA上构成无形的区域---“板块”。 每个板块在进化上非常保守，在多世代的传递中没有或极少发生DNA重组，其SNPs的构成在单个染色体上的模式，即单体型（Haplotype，图1）。 不同个体的DNA序列上的差异因而可以准确的用SNP的始祖板块或单体型表示。

特别是，对于一种单体型来说，只需几个位点作为其标签（tag）SNPs，便可知道整个单体型的模式。 由此绘出揭示人类遗传多态信息的“单体型图”，从全基因组规模大大简化以后的SNP分型研究，为疾病相关的遗传多态研究提供SNP标签位点。

图 单体型图示意。a 一段DNA上的SNP位点。来自4个不同个体的相同染色体区域的这一段DNA的大部分序列完全相同但有3个位点表现出差异。每个SNP有两个可能的等位位点（alleles），第一个SNP的可能等位位点是C和T。b 单体型。一个Haplotypes由临近的一系列SNP等位位点组成，图中显示从一个6000 bp DNA片断上检定出的20个SNPs的排布类型，包括a中的3个位点（第二排箭头），大多数人群的染色体均显示有Haplotypes 1-4。c 标签SNPs。只要检定分型20个SNPs中的3个，就足以确定这一段序列的单体型。例如，如果测出一个染色体的3个标签SNPs是A - T – C，则这一序列是单体型1。（转引自The International HapMap Consortium. The International HapMap Project, Figure 1. Nature, 2003；426）

通过表型与全基因组SNPs图谱的相关研究,理论上可将人类的任何表型、功能、对任何疾病的易感性加以定位,从而对疾病遗传机制的阐明做出重要贡献。 然而，即使找到了疾病易感基因和特异性分子表型，也不等于阐明了疾病发生发展的分子作用机理。最终阐明机理尚需进一步搞清楚：该疾病易感基因涉及哪些信号传导通路？ 这些信号传导通路之间如何发生作用和影响？疾病易感基因在这些信号传导通路内是如何发挥作用及是否与信号传导通路之外的分子发生作用？

什么是 HapMap

HapMap是人类基因组中常见遗传多态位点的目录，它描述了这些变异的形式、在DNA上存在的位置、在同一群体内部和不同人群间的分布状况。 HapMap计划并不是利用HapMap中的信息来建立特定的遗传变异与某一疾病之间的联系，而是为其他研究者提供相关信息使之能够将遗传多态位点和特定疾病风险联系起来，从而为预防、诊断和治疗疾病提供新的方法。

我们细胞中的DNA是由四种基本化学“构件”——腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）所组成的长链。人类细胞中的23对染色体就是由多于60亿个这种化学单位排列而成。 （见“http://www.dnaftb.org/dnaftb/上的遗传学基本知识”）。这些遗传序列包含的信息可以影响我们的身体性状、罹患疾病的可能性以及身体对遇到的外界物质的反应。

不同人的遗传序列极为相似。若比较两个人的染色体，他们的DNA序列上可以连续数百个核甘酸都是相同的。 然而，平均约每1200个碱基就会有一个核甘酸的不同（图1）。在一个位点上某人是A，另一个人却有可能是G；或者某人在特定的位点上多出或者缺失一些碱基或DNA片段。 染色体上每一个不同的“拼写”被称作一个等位位点（allele），一个人染色体上的所有等位位点的集合就是基因型。

图1：当比较两个随机个体的7号染色体上的一段DNA序列时， 在2200个核甘酸中出现两个单核甘酸多态位点（SNPs）。

不同个体的碱基的差别是目前最常见的遗传多态现象，这些遗传上的差别称为单核苷酸多态性或SNPs（发音为“snips”）。

对遗传学家来说，SNPs也是进行基因定位的分子标记。比如说基因上一个拼写的改变会增加罹患高血压的风险， 如果某一个SNP在高血压患者中很常见，就可以把这个SNP作为标记来定位和识别与这一疾病相关的基因。

然而，检测人类染色体上所有的一千万个常见SNPs的费用极其昂贵。 HapMap的构建将使得遗传学家可以利用SNPs及其它遗传上的变异在染色体上的组成特点。 一些相互邻近的多态位点趋向于在一起共同遗传。例如，对于所有那些在某一位点是A而不是G的人来说，该位点周围染色体区域上的SNPs状况很可能是一致的。这些变异连锁的区域就是单体型

图2：HapMap的构建分为三个步骤：（a）在多个个体的DNA样品中鉴定单核苷酸多态性（SNPs）；（b）将群体中频率大于1%的那些共同遗传的相邻SNPs组合成单体型；（c）在单体型中找出用于识别这些单体型的标签SNPs。通过对图中的三个标签SNPs进行基因分型，研究者可以确定每个个体拥有图示的四个单体型中的哪一个。

在人类染色体的很多区域中，只发现了少数的几种单体型 。在一个特定人群中，55％的人可能拥有同一种单体型，30％的人可能拥有另一种单体型，8％的人可能拥有第三种单体型，而其余的人可能拥有若干种稀有的单体型。 HapMap计划将鉴定来自世界不同地区的四个群体的常见单体型，以及特异识别这些单体型的标签SNPs。通过检测个体的标签SNPs（该过程称为基因分型）， 研究者就可以鉴定一个人的单体型的集合。估计包含了大多数遗传变异的模式信息的标签SNPs的数量大约是30万至60万，远远少于一千万个常见SNPs。

一旦从HapMap中获得标签SNPs的信息，研究者将能利用它们来定位与重要医学特征相关的基因。 假设研究者想要找到与高血压相关的遗传变异，他并不需要确定一个人的所有SNPs的类型，而只须对少得多的标签SNPs进行基因分型就可以得到一个人的单体型的集合。 研究者可以集中研究可能与疾病相关的特定候选基因，也可以纵观整个基因组来找到与疾病相关联的染色体区域。如果高血压患者都倾向于具有一个特别的单体型，与该疾病相关的变异位点很可能就在这个单体型内部或邻近区域。

单体型的起源

人类基因组中的单体型源于人类有性生殖的分子机制和我们作为一个物种的历史。 除性细胞外，染色体在人类细胞中成对出现。其中一条染色体来自父方，另一条来自母方。但染色体在一代代的传递过程中并不是一成不变的。 在精子和卵细胞形成的过程中，染色体对发生重组，即一对染色体中聚集到一起并交换片段。由此产生的杂合染色体含有这对染色体的两个成员的片段，并传递给下一代。

多代之后，经过反复的重组事件，祖先染色体的片段的原有排布在非近亲结婚的人群中已被打乱。 某些祖先染色体片段会在许多后代个体的DNA序列中出现（图1）。这些是没有被重组打破的区段，相互间被那些发生了重组的区域隔开。 这些区段就是单体型，遗传学家利用它可以寻找与疾病或者其它医学上的重要特征相关的基因。

图1：图示两个祖先染色体经过多代的重组拼接产生不同的子代染色体。如果祖先染色体上的一个多态位点（用X作为标记）会增加罹患某种疾病的风险，当代的两个遗传了祖先染色体的带X标记部分的个体也会增加这种风险。被X标记的变异附近有许多SNPs可以用来定位此处变异。

解剖学上的现代人类始祖居住于15万年前的非洲，化石记录和和遗传证据表明现在所有的人都起源于此。 因为人类是一个相对年轻的物种，任何现代人群的大多数变异都来自于祖先中就已经存在的多态性。 当人类走出非洲的时候，他们带走了部分而不是全部的祖先的遗传多态性。因此，非洲以外的单体型可以看作是非洲单体型的子集。 非洲以外的人类的单体型比非洲人的单体型更长，因为非洲人有更长的历史，也就有更多的重组来打破单体型。

随着现代人遍布到世界各地，由于随机性、自然选择和其它的遗传机制，各个地区的单体型频率也变得不同。 一个已知的单体型在不同人群中会出现不同的频率，特别是那些分布广泛而且在婚配过程中不可能发生大量DNA交换的人群。 另外，DNA序列新的变化（即突变），也可以产生新的单体型，大多数这种新近产生的单体型没有足够的时间传播到其他的人群和地区。

如何解释伦理学问题？

国际HapMap计划引起一些已有的和新提出的伦理学问题。通过初期的设计考虑以及遗传学家与伦理学家之间持续的密切合作，项目已经解释了这些伦理问题。 项目中用到的个体DNA样品被标识为男性或女性，以及来自于四个参与人群中的哪一个群体；三体家系样品中还标识出是来自于父亲、母亲还是孩子。样品中牵涉到识别个人的信息是隐匿的，任何样品中都没有私人信息。 另一个安全措施是每个参与人群收集到的样品数都多于研究所需，因此无人知道某个人的DNA是否用在研究当中。同时，捐赠者的医学或表现型（phenotype）信息也不在收集范围之内。

由于这些样品不包括任何个人标记，危及捐赠者个人隐私的风险也就降至最低。 然而，因为可以确定某个样品是来自哪一个人群[见“HapMap出版和介绍中关于项目取样群体的指导方针 ”]，使用HapMap进行的研究可能会产生对群体的歧视。 例如，研究者可能会发现与某种疾病高风险相关的一个遗传变异在某个人群中比在另一个人群中更为常见，而这个信息可能被错误地解释为该人群中的每个人都有患这种疾病的高风险，即使这种高风险只出现在那些拥有这个变异的人身上，而不论这些人是否属于这个人群。

同样，遗传学上的发现可能会破坏已有的文化或宗教传统、法律状况和政治次序。 很多民族对自己的起源及其与其他民族的关系都有坚定的信仰，这些信仰也许会受到使用HapMap带来的新发现的挑战。 另外，遗传学上的发现可能会与群体已经建立的自我认同的社会和文化方式相冲突。

最后，这一计划的结果可能会被错误解释为象“种族”这样的概念含有准确和属于具高度生物学意义的范畴的意味。 事实上，这一项目得到的信息有助于阐明种族的形成很大程度上是源于社会和文化的相互作用，而与生物学的祖先仅有松散的联系这一普遍观点。

这一计划在多个方面阐述了伦理学问题。每个DNA样品的捐赠者个人都同意参加这个项目，并签署了 知情同意书 ，允许将他们的DNA样品用于除HapMap项目之外将来的经过相关伦理委员会批准的其他研究之中。针对各个族群的意见，知情同意书也进行过修改并得到各自伦理委员会的批准。

此外，在寻找那些已经知道知情同意书内容的人之前，HapMap项目开展社区参与活动。 在参与该计划的各个社区内，由遗传学家和伦理学家组成的小组向社区成员介绍项目内容，和他们讨论相关问题，如如何采样，如何描述这些样品。社区参与活动在各个国家进行的不尽相同，但多是由单独面谈、中心小组谈论、社区会议和公众调查等几个方面组成。 社区参与有助于研究者了解公众的态度、信仰和他们所关心的问题，并对此作出反应。另一方面，社区参与有助于社区和个人了解HapMap计划的本质和目标。 同时，社区参与还创造了一种风气，即科研工作能够在更开放和信任的气氛中进行。

在每个参与项目的社区中，社区顾问委员会（CAG）是联系社区与存储样本的Coriell研究所的纽带，从那里社区成员可以了解他们样品是如何使用的。 由于在任何样本中都没有个人标记，已无法再同捐赠者个人取得联系以获得他们对新的研究项目的同意。 同样原因，样品捐赠者也不能将他们的样品从储存处撤回，尽管整个社区在同研究者进行讨论和磋商后有权决定是否从存储处撤回该社区的所有样品。

HapMap项目本身不会发展药物或其他商品。 尽管可能需要多年的时间，HapMap最终将有益于所有人类包括那些参与HapMap项目的社区在内的健康。

知情同意书

由遗传学者和伦理、法律和社会影响等领域涉及遗传研究的专家组成的群体/伦理、法律和社会影响委员会（http://www. genome 由遗传学者和伦理、法律和社会影响等领域涉及遗传研究的专家组成的群体/伦理、法律和社会影响委员会（http://www.genome.gov/10001685）在计划初期阶段提供了有关建议，并制定了知情同意书的模板。 这个模板经过参与尼日利亚、日本和中国取样工作的研究者的改进，形成了适用于当地文化背景区域的知情同意书。 完善后的知情同意书被译成约鲁巴语、日语和汉语，并得到当地相关的伦理委员会的批准。这一模板还同样被修改成为用于获得对已有的犹他州CEPH样本捐赠者的再次同意的知情同意书，这种同意书也已获得当地伦理委员会的批准。此外，某些地区还向预期的捐赠者附加提供了适当的文字解释材料。

（2）寻找影响这些基因表达的表观遗传修饰因子如DNA甲基化等和环境因素 生物基因组以两种形式储存信息： ① 遗传学 为生命功能蛋白质的制造提供蓝图 ②表遗传学（epigenetics） 主司何时何处基因表达制造相关蛋白，确保基因在需要时能及时激活和在不需要时及时关闭。

（2）寻找影响这些基因表达的表观遗传修饰因子如DNA甲基化等和环境因素 表遗传学作用，指由于基因（组 ）的修饰作用（甲基化）和组蛋白的修饰作用（甲基化、磷酸化或乙酰化等）所致基因表达作用谱的改变。 所以表遗传作用并不改变基因序列和遗传密码，只改变基因表达方式和强度，属基因表达调控范畴。 表遗传学现象广泛地存在于各种生物中,而DNA甲基化作用引起基因转录沉默是表遗传现象形成的重要机制。

几乎所有疾病的发生都与基因表达调控失常有关。如肿瘤中存在的表遗传改变主要包括普遍性低甲基化、个别基因的低甲基化、区域性CpG岛的高甲基化以及印记丢失. （哺乳动物某些组织和细胞中,控制某一表型的一对等位基因由于亲源不同而差异性表达,即机体只表达来自亲本一方的等位基因,而与其自身性别无关。这就称为基因组印记(genomicimprinting)。 其中父(母)系等位基因不表达者,就称为父(母)系印迹。它是等位基因排斥作用的一种形式,是通过某种特异的基因修饰机制来特异地抑制另一父系或母系等位基因表达。它不遵守孟德尔遗传规律）。

3．获得性基因病： 由微生物感染引起，多数不会遗传，如肝炎、艾滋病等传染性疾病。

（二）分子病 分子病是指由于基因突变，使蛋白质的分子结构或合成的量异常，直接引起机体功能障碍的一类疾病，它包括血红蛋白病、血浆蛋白病、受体病、膜转运蛋白病、结构蛋白缺陷病、免疫球蛋白缺陷病等。

（二）分子病 蛋白质分子的合成是由基因控制的，是由DNA分子上的碱基序列决定的。 由此可能引起相应蛋白功能的减弱或丧失，如株蛋白生成障碍性贫血；也可出现功能增强的突变蛋白；甚至形成新特征的突变蛋白，如镰形红细胞贫血（β链基因突变形成突变血红蛋白HbS）。

第三节 细胞器分子病理学 一、线粒体分子病理学 线粒体是细胞的氧化中心和动力站。 线粒体基因组由16569bp组成的呈闭环双链结构，分为控制区和基因编码区。 控制区即D-环区，整个D环控制区位于16024～576 np，片段大小为1122bp； 其中含有三个高变区: 高变区Ⅰ位于16024-16383np, 高变区Ⅱ位于57-372np, 高变区Ⅲ位于438-574np。

第三节 细胞器分子病理学 一、线粒体分子病理学 人类mtDNA在此区间存在着大量的碱基差异,具有很高的序列多态性。 由于它的无重组遗传和碱基的高突变频率,对群体遗传学、分子进化、人类生态学、考古学、法医学以及病理学研究都具有重要意义。 通过对线粒体基因限制性内切酶片段长度分析或控制区的序列对比并建立地理特异性的单体群，从而有助于疾病的研究。 编码区包括2种rRNA 基因、22种tRNA基因和13种多肽编码基因（细胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚基,NADH 脱氢酶的7 个亚基,细胞色素b 以及ATP 酶6 、8 亚基）。

（一）其主要特点有： 1. 多拷贝数：每一个细胞中含有约成百上千个拷贝 1. 多拷贝数：每一个细胞中含有约成百上千个拷贝 2. 异质性：同一细胞或同一个体内存在两个或两个以上的mtDNA亚群! 它包括点异质性和长度异质性 3. 突变率高： 由于mtDNA裸露，突变率较核DNA 高10倍 4.不均等的有丝分裂分离：可导致突变mtDNA的比例在子代细胞中可能会发生变化，从而有可能影响表型随之发生改变。 5. 阈值效应：突变mtDNA达到一定的比例，才会导致病变发生。 6. 母系遗传

7. 不同mtDNA突变可导致相同疾病，而同一突变也可引起不同表型 8. 突变相加效应：多种突变中可观察到两个以上突变的协同致病作用 9. 年龄效应：突变的发生和积聚随年龄增长而增多 10.核背景作用：线粒体的DNA和RNA合成的聚合酶都是由细胞核基因组编码的，氧化磷酸化系统的组装和维护亦需要核DNA和mtDNA的协调，因此mtDNA 遗传系统只有依靠核基因所合成的大量多肽类物质的协调才能发挥作用。个体核遗传背景对mtDNA突变的形成、表达和组织特异性有明显影响。

图22－2 线粒体分子结构模式图（参照Medical Genetics,张国红修改绘制）

（二）常见的线粒体疾病及其分子病理学研究 线粒体疾病主要是指由于mtDNA缺陷和核DNA缺陷所导致的一类疾病。 肿瘤组织中mtDNA无论是数量还是结构都发生了改变，在不同来源的正常组织的线粒体中mtDNA的含量都比较接近，平均1mg线粒体蛋白含0.2-0.5ug mtDNA.但在肿瘤组织中mtDNA的含量明显增加。

线粒体DNA缺陷主要是指mtDNA突变，其突变方式分为两类： （1）点突变：包括错意突变（突变导致编码氨基酸顺序的改变）和生物合成突变（突变发生在编码tRNA的基因上，表型呈异质性）。 （2）缺失-重排突变：点突变使mtDNA双链分离机会增加，进一步发生缺失重排突变。

线粒体DNA缺陷主要是指mtDNA突变，其突变方式分为两类： mtDNA突变与肿瘤关系密切, 研究显示D310区是位于D环区303-315np 的polyC 序列,是实体瘤的突变热点,其突变形式多为单碱基插入或缺失。口腔癌、宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌及子宫内膜癌中均存在D310区突变。也有研究显示不同组织发生的肿瘤mtDNA 突变位点存在差异。 由于肿瘤组织中mtDNA的拷贝数远比核DNA的拷贝数要多，其检测的敏感性也要比核DNA高。因此从体液中提取mtDNA进行体外聚合酶链反应扩增，来检测mtDNA突变的位点，对于肿瘤的早期诊断具有很大的意义。

二、细胞骨架分子病理学 (一) 细胞骨架正常结构与功能 细胞骨架（cytoskeleton）是细胞质内横越在细胞核和质膜内侧面的一种纤维状蛋白基质，细胞骨架由微管（microtubule）、微丝（microfilament）及中间丝（intermediate filament）组成，分别由不同的蛋白单体组装而成。

1. 微管 微管为中空的直管状结构，外径约22nm，内径约15nm 1. 微管 微管为中空的直管状结构，外径约22nm，内径约15nm.其管壁由13根原纤维(protofilament)纵向包围而成，原纤维由微管蛋白（tubulin）组成。其功能具有：构成细胞的网状支架，维持细胞形态；固定与支持细胞器的位置；参与细胞的收缩与伪足运动，是纤毛和鞭毛等细胞运动器官的基本构成成分；微管在细胞内可能起着运输大分子颗粒的微循环系统的作用；参与细胞内信号转导

显示细胞核和微管(引自www.DXY.cn)

2．中间丝 中间丝直径7-11nm,单根或成束分布于细胞质中,常形成精细发达的纤维网络,其外与细胞膜及细胞外基质相连,其内与核纤层有直接的联系。其功能赋予细胞强大的机械强度,维持细胞的形态结构与功能. 3.微丝 微丝直径约6nm,为肌动蛋白(actin)亚单位组成的螺旋状纤维.肌动蛋白的分子量约43kD,其立体结构由两个结构域(domain)组成,两个结构域之间有腺苷酸(ATP或ADP)和二价阳离子(Ca2+、Mg2+或Sr2+)的结合位点。

显示细胞核和肌动蛋白 (引自www.DXY.cn）

细胞核和微丝显示细胞核和微丝(引自www.DXY.cn）

（二）细胞骨架分子病理学 1. 细胞骨架与肿瘤 细胞骨架在细胞的生命过程中充当重要角色,细胞恶变时细胞骨架异常的结构和功能是导致肿瘤失控的重要因素. （1）肿瘤细胞内的微丝 肿瘤细胞内微丝束减少,并常出现成片的肌动蛋白凝聚小体。微丝的组装和分布发生异常，似与肿瘤细胞的生长与增殖失控有关,但其因果关系尚不清楚。 （2）细胞内的微管 肿瘤细胞中的微管数仅为正常细胞内微管数的二分之一.对比观察人食管癌细胞和正常食管上皮细胞微管在细胞周期内的变化发现：癌细胞微管的变化主要发生在间期,而在分裂期,纺锤体微管与正常细胞相同。 （3）肿瘤细胞内的中间丝 活体内肿瘤细胞的中间丝的形态、超微结构和免疫学特征均与正常细胞表现相同，仅在化学组成上有所改变。

2. 细胞骨架与衰老 衰老机体内各种细胞的特征主要表现为功能低下。衰老的小鼠腹腔巨噬细胞内肌动蛋白微丝较年轻小鼠同种细胞内微丝数量减少。衰老动物神经元中的微管数目也明显减少。

3. 细胞骨架与神经系统疾病 阿尔茨海默(Alzheimer disease,AD)患者的神经元中可见到大量损伤的神经原纤维,它们由成对的螺旋状中间丝组成,并含有过度磷酸化的tau蛋白，孤立的微管蛋白与结合的微管蛋白均可以过度磷酸化的方式与其他配体结合形成稳定的tau蛋白。

4. 中间丝蛋白基因突变引起的遗传病 表-1 中间丝蛋白基因突变与遗传病 疾病 涉及细胞 种属 突变基因 EBS 上皮基底层 人类、小鼠 表-1 中间丝蛋白基因突变与遗传病 疾病 涉及细胞 种属 突变基因 EBS 上皮基底层 人类、小鼠 x5，k14 EBS伴肌营养不良 人类 plectin EBS伴感觉神经元退行性变 上皮基底层、背根神经节 小鼠 bpag1 EHK、EPPK k1、k10、k2e、k9 先天性甲肥厚 甲、毛发 k6、k16、k17 白色海绵痣 食管、口腔上皮 k4、k13 串珠形发 毛发 角质蛋白 hb6 慢性肝炎、隐原性肝硬化 肝 k18 大肠上皮增生 结肠 k8 运动神经元疾病 运动神经元 nf-1 引自李玉林主编《分子病理学》第七章（李一雷教授编写）人民卫生出版社2002 EBS: 单纯性大泡性表皮松懈症( epidermolysis bullosa simplex, EBS) EHK：表皮松懈性角化过度症(epidermolytic hyperkeratosis, EHK) EPPK：表皮松懈性掌趾角化病。（epidermolytic palmoplantar keratoderma, EPPK）

第四节 生物膜及其分子病理学 一、 生物膜结构 生物膜（biological membrane），包括细胞膜及真核细胞的内膜系统，形成膜性结构或细胞器。其基本结构是脂质双分子层，蛋白质分子嵌合在脂质双分子层中，即电镜下的内外两层致密的深色带和中间层的浅色带，膜厚度在8~10nm之间。这些膜性结构或细胞器均含有其特殊的酶系或蛋白质，在细胞内各自独立地执行其功能。 以下主要以细胞膜为例来介绍生物膜的分子病理学。

二、细胞膜分子病理学 细胞膜是包围在细胞外表面的一层界膜，又称质膜（plasma membrane）。组成细胞膜的化学成分有膜脂、膜蛋白、膜糖类。细胞膜的形成使生命体具有更大的相对独立性，并由此获得一个相对稳定的内环境；细胞膜且具有高度选择性的半透膜，并且能进行物质的主动运输，控制营养物质的进入和废物的排出；还是接受外界信号的感受器，使细胞能对环境变化产生适当的反应。

图22-3 细胞膜分子结构模式图（引自basic histology,张国红编译）

细胞膜的分子病理学 细胞膜与肿瘤 ①瘤细胞膜表面糖链短缺不全：瘤细胞表面糖基转移酶活性降低，而糖苷水解酶活性增强，细胞外被的糖链不能接触延伸，失去接触抑制和密度依赖性生长调节，导致增殖失控。

细胞膜的分子病理学 (1) 细胞膜与肿瘤 ②蛋白改变：各种肿瘤细胞都有粘连蛋白的缺失，失去原来正常细胞与细胞之间的粘着作用，这样肿瘤细胞彼此之间的粘着性和亲和力降低，使肿瘤细胞易于脱落，浸润病灶周围组织或者通过血液和淋巴液转移到其他部位； 肿瘤细胞糖蛋白的糖链发生改变，表现为糖蛋白出现唾液酸化，使癌细胞表面唾液酸残基增加，导致肿瘤细胞免疫逃避现象的发生；动物实验发现肿瘤细胞还可以合成新的糖蛋白，掩盖其主要组织相容性抗原。

③糖脂改变：肿瘤细胞糖脂的改变主要是糖链缩短及糖基缺失所造成的，可能与酶的活化或抑制有关。 ④表面降解酶的改变：肿瘤细胞表面的糖苷酶和蛋白水解酶活性增加，使细胞膜对蛋白质和糖的传送能力增强，为肿瘤细胞的分裂和增殖提供物资基础。 ⑤癌基因表达产物增多及细胞表面出现异常的抗原和受体：消化道肿瘤细胞表面可出现癌胚抗原（CEA），肾上腺皮质癌细胞出现正常细胞表面没有的β受体。人鳞癌细胞表面表皮生长因子（EGF）受体比正常细胞高50倍以上，另外肿瘤细胞表面凝集素受体含量增加。

⑥肿瘤细胞连接异常:肿瘤细胞连接数目减少，间隙连接通讯中断，紧密连接丧失或解体，改变细胞侧壁的通透性；膜下微丝数减少，排列无规则，粘着连接松散，使细胞和结缔组织脱离。 ⑦多数肿瘤细胞出现有氧酵解：有氧条件下的反巴斯特效应使细胞膜的糖吸收量增加，受体介导胞吞作用加快，而且腺苷酸环化酶活性下降，信号跨膜转导受阻，细胞代谢紊乱。

(2) 细胞膜与遗传性疾病 ①细胞膜受体蛋白异常与遗传性疾病：如在无丙种球蛋白血症患者的B淋巴细胞膜上,缺少作为抗原受体的免疫球蛋白；家族性高胆固醇血症的发病机制包括LDL受体缺陷、受体对LDL连接部位的缺失或受体有被小窝的缺失。 ②细胞膜载体蛋白异常与遗传性疾病：如胱氨酸尿症为遗传性疾病，其机制是细胞膜上缺少胱氨酸载体蛋白。

(3) 细胞膜与细胞的衰老 ①细胞膜上的微绒毛数目增加：以补偿细胞衰老时细胞间联系能力衰退。 ②细胞膜的流动性降低：衰老的细胞膜发生脂质过氧化反应，流动性明显减弱，因而细胞的兴奋性降低，离子转运的效率下降，对内源性和外源性刺激的反应性也随着降低。 ③细胞膜受体-配体复合物形成效能降低：细胞衰老时，细胞膜上的受体、蛋白质或糖蛋白与配体结合形成受体-配体复合物的效能降低，其流动性范围也缩小。

第五节 细胞外基质及其分子病理学 细胞外基质（extracellular matrix,ECM）主要由胶原、粘附性蛋白、基质细胞蛋白、蛋白聚糖和透明质酸素等组成。 以下主要介绍基膜分子病理学。

一、基膜的结构和化学组成 基膜为广泛存在于细胞与结缔组织之间的细胞外基质结构，厚约40~60nm.电镜下,基膜结构一般可分为3层:外层(靠近上皮细胞)、致密层和内层（靠近结缔组织）。

一、基膜的结构和化学组成 基膜成分复杂，有些蛋白质存在于所有基膜中，包括Ⅳ型胶原、层粘蛋白(laminin)、蛋白聚糖(proteoglycan)和巢蛋白(nidogen)等;有些蛋白质则只存在于部分基膜中,包括Ⅴ型胶原、纤连蛋白（fibronectin）和硫酸软骨素(chondroitin sulfate)等 . 基膜的生理功能包括维持某些组织结构的强度张力，如肾小管、血管和晶状体囊等；细胞粘着；并有超滤作用和电屏障作用，尤其是位于毛细血管和肾小球的基膜。

二、基膜的分子病理学 病理过程中基膜的改变涉及其结构和各种组成成分，包括胶原、粘着成分和蛋白聚糖，在形态学上可见基膜增厚，如膜性肾小球肾炎和糖尿病毛细血管壁基膜增厚；基膜破损可导致的牛皮癣；细胞周基膜胶原沉积所导致的动脉硬化性平滑肌斑块。

疾病过程中基膜的分子改变常见有： 胶原异常：可为合成和降解的平衡发生紊乱，如维生素C缺乏可造成胶原合成障碍；亦可表现为胶原分子结构异常或组织中各型胶原的比例失常； 胶原与基质中其它大分子间的交联发生异常。胶原蛋白可引起自身免疫性疾病，人体丧失对自身胶原组织结构的免疫耐受即可发生自身免疫性胶原损伤，如类风湿性关节炎及肾小球肾炎等。

2. 纤连蛋白（fibronectin）异常： 血浆中的纤连蛋白可与DNA、金黄色葡萄球菌、链球菌、胶原和纤维蛋白的降解产物结合，避免其沉积于肾小球引起肾小球肾炎，如果血浆中的纤连蛋白浓度降低，则失去对肾的保护作用。

3.层粘蛋白(laminin)异常： （1）基底膜中层粘蛋白的含量减低：如糖尿病肾小球基底膜降解导致血清中出现基底膜的降解产物。 （2）抗层粘蛋白抗体的产生：在链球菌感染及锥虫感染患者血中出现抗层粘蛋白抗体，而引起自身免疫反应，导致某些器官的基膜损害，在扩张性心肌病与心肌炎患者中也能检测到层粘蛋白的自身抗体。

4.蛋白聚糖（proteoglycan）异常： 蛋白聚糖是氨基聚糖（除透明质酸外）与核心蛋白质（coreprotein）的共价结合物。 蛋白聚糖对血管壁、心肌间质、甚至大脑皮层发育均有密切的关联，其含量、结构与功能的异常都会对机体产生影响。 如动脉壁中的氨基聚糖和蛋白聚糖随年龄的增加而改变，如硫酸软骨素的含量降低，硫酸皮肤素的含量增高，有利于脂质沉积，促使动脉壁中动脉粥样硬化的形成。

(引自WWW.DXY.cn)

(引自WWW.DXY.cn)

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