酶联免疫吸附测定基础知识（ELISA） 郑州德歌生物工程有限公司
一 ELISA简介 1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA）
二 ELISA的基本原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原及抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或者抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其它物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相载体上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与受检物质的量直接相关，因此可以根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
抗原和抗体 1.抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。 2.抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。
ELISA原理图
三 ELISA的种类 1.直接法 2.双抗夹心法 3.间接法 4.竞争法
1.直接法 直接法只能用来测定抗原 ： 1. 将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2.加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 3.加底物反应。固相上的酶催化底物成为有色产物，此时底物的降解量＝抗原量。
2.双抗夹心法 双抗夹心法，此法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于测半抗原抗体及小分子单价抗原抗体，此法既可以测抗体又可以测抗原： 测抗原的原理： 1.将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2.加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其它未结合物质。 3.加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4.加底物反应。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 双抗夹心法测抗体的反应模式与测抗原类似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
双抗夹心法测抗原原理图
双抗夹心法测抗原流程图
3.间接法 原理：利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。 操作步骤： 1.将特异性抗原与固相载体连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2.加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其它成份在洗涤过程中被洗去。 3.加酶标抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 4.加底物显色。
间接法测抗体原理图
间接法测抗体流程图
4.竞争法 原理：标本中的抗体（抗原）和一定量的酶标抗体（抗原）竞争与固相抗原（抗体）结合。标本中抗体（抗原）量越多，结合在固相上的酶标抗体（抗原）愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
四 实验操作步骤 1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。 2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。 4. 洗涤同2。 5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。 6. 洗涤同2。 7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。 8. 洗涤同2。 9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。 10. 加终止液：每孔50微升。 11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
五 实验注意事项 １．正式实验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制实验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 ２．在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，包括 (1) 固相载体的选择： 许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管等。目前常用的是96孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2） 包被抗体(或抗原)的选择： 将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9. 0～9 （2） 包被抗体(或抗原)的选择： 将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。 (3) 酶标记抗体工作浓度的选择： 首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择： 对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2临用前加入。 （5）样品： 通过查文献或预实验大概确定标本中样品含量，再对样品进行稀释，加样。
六 ELISA的特点 特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml 。
特点二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。
评价 1.既可测抗原又可测抗体 2.既可定性又可定量 3.操作简便不需特殊仪器 4.特异性强敏感度高 5.缺点是可出现假阳性
七 ELISA应用实例 ELISA在饲料安全检测中的应用 饲料中盐酸克伦特罗的测定 ELISA用于农药残留的检测 甲胺磷残留分析 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ） ELISA用于农药残留的检测 甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析
农药的检测： 主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如：杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘 河豚毒素
ELISA在疾病诊断中的作用 ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体 ELISA法检测幽门螺杆菌抗体
八 ELISA 试剂盒 试剂盒：Kit，用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等或实现某个生化反应的化学试剂的盒子。 原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。 ELISA在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。所以ELISA试剂盒具有很广的市场，加之其后期生产成本低廉，于是极具商业价值。
完整的ELISA试剂盒包括： 1 已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； 2 酶标记的抗原或抗体（结合物）； 3 酶的底物； 4 阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）； 5 酶联物（结合物）及标本的稀释液； 6 洗涤液； 7 酶反应终止液。
一些ELISA试剂盒:
酶标分析仪
相关实验用品
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