歡迎你們的參訪 1. 盧佩眉- 從電分析技術到生醫感測器之開發應用 2. 楊筱嵐- 電阻抗分析與其生醫奈米免疫檢測應用 解說者 主 題 1. 盧佩眉- 從電分析技術到生醫感測器之開發應用 2. 楊筱嵐- 電阻抗分析與其生醫奈米免疫檢測應用 3. 熊翌成- 原子力顯微鏡的液相中的細胞影像呈現 4. 楊梅玉- 拉曼(Raman)光譜法的原理和應用 5. 劉興倫- 二維與三維介電泳微流體晶片的微粒分離 成大醫工所 生醫感測實驗室 負責人：張憲彰教授 2010/08/09

電分析技術生醫感測器之開發應用 23°C 定義：依據電化學和分析化學的原理及實驗測量技術獲取物質的質和量及狀態信息的一門技術。 將測定的對象構成一個化學槽的組成部分，藉由通過測量電池的物理量，如電位、電流、電導或電量等，求得物質的含量或測定某些電化學性質。 Light Chemistry Sound 23°C Heat 轉能器Transducer 生物固定 基材 特異性分子 識別層 檢測樣本 訊號輸出 （光學、電化學、波動振盪學、熱學） Target Conc. Signal

電池的原理到電分析化學 電化電池(Galvanic cell ) 電解電池(Electrolytic cell ) 自發性反應，指兩個電化學活性物質在同一電解質中透過固體的電子通路而產生氧化還原反應，例如電池 。 電解電池(Electrolytic cell ) 非自發性反應，施與外在電壓，利用外在電流強迫在同一電解質裡的兩極產生氧化還原反應，如電鍍 。 化學能→電能 電能→化學能

兩極式與三極式的電化學系統 1 雙電極體系: 三電極體系: A V 2 可得知兩極間的電位 無法得知個別電極 反應的電位 可得知個別電極反應的電位 1 3 2 V A Reference electrode 1 2 Counter electrode Working electrode

Electrochemical Reaction Electrode Solution Vacant MO Ox + ne Red Energy level of electrons Occupied MO e- OX Red Electrode Reduction Oxidation Red e- OX Electrode

Electrochemical Reaction Solution e- Vacant MO Electrode Potential Energy level of electrons Occupied MO A + e- A- Reduction process Solution Vacant MO Energy level of electrons Electrode Potential e- Occupied MO Oxidation process A+ + e- A

Outline of Electrochemistry C R W e e

Electrochemical Biosensors 1st Generation Substrate O2 Oxidase Oxygenase O2 Electrode O2 Product 2nd Generation Mred Dehydrogenase Peroxidase Oxidase Substrate Electrode Mox Product 3rd Generation Electrode Dehydrogenase Peroxidase Oxidase Product Substrate 微奈米科技 + 生物科技

Glucometer Measurment of Glucose in Blood Glucose + Fe(CN)63- Gluconic Acid + Fe(CN)64- Electrode e Measurment of Glucose in Blood 1. Time 30 sec 2. Sample 3 ml 1 ml 3. Range 20 – 600 mg/dl (1~33 mM) (90/180)10 = 5 mM Since 1991, 2,000,000,000 glucometers were produced

Disposable Tip 血容比 (Hematocrit, Hct) Male : 0.42 ~ 0.52 Cover Male : 0.42 ~ 0.52 Female: 0.36 ~ 0.48 Spacer 100 mm Glucose Oxidase (GOD) + Fe(CN)63- 100 mm

Development of Self-Monitoring Blood Glucose (SMBG) System in Taiwan 五鼎生技公司 泰博科技公司 黃金血糖測試片 GM300 - 血糖監測系統 (華廣生技公司)

以禪譜科技的電化學組進行現場操作示範 三極式電極 Working electrode Carbon Reference electrode Ag/AgCl Counter electrode 所需樣品量 約 1 ml

以Fe(CN)4-為例，用網版印刷碳電極現場操作示範

電極電位窗 在電位範圍內，電解液無氧化還原的反應產生，離子液體的電位窗範圍不受水氧化還原反應產生之氧氣及氫氣影響，可依使用鹽類種類的不同及其組成比例與電極材料而有所變化。 V1 V2

循環伏安法(Cyclic Voltammetry, CV) 不同的分析物，其電子分佈軌域與能階變化均不太相同，藉由施加一與時間成線性關係的電位於工作電極上，當工作電極上的分析物種因施加的電位而產生氧化(oxidation)或還原(reduction)電流時，紀錄循環電位與其氧化還原之間的方法的方法稱之。 藉由分析物可發生氧化還原反應的電位及電流大小，配合反應速率公式，可以探討出分析物的動力學常數及電極表面之行為 n: 電子轉移數, A : 電極面積 D0 : 擴散系數, C0 : 濃度, V : 掃描速率

Effect of Scan Rate (掃描速率的影響) for the reversible electron-transfer situation ← 斜率增加 ↑電流增加    

循環伏安法(CV)及電極電位窗 實驗目的 1. 觀察不同工作電極的CV圖、工作電位窗及背景電流。 2. 觀察在不同掃描速度對CV圖的影響。 3. 循環伏安法量測工作電極的電化學有效面積。 實驗步驟 1.電極清潔：以氧化鋁粉(Φ: 0.1 mm)拋光研磨 2.於背景溶液(0.05 M PB (pH 7.4))中進行CV法掃描，改變掃描速率 3.實驗儀器架設 4.電腦軟體操作 Working electrode: Au (Φ: 3 mm ) Pt (Φ: 1 mm ) GC (Φ: 3 mm ) Counter electrode: Pt Reference electrode: Ag/AgCl Buffer: PBS(磷酸鹽) CHI 705 B

比較不同電極的CV圖譜 H+脫附 Pt 還原 Au 氧化 Au 還原 H2 產生 與Au、Pt電極比較，GC電極在-1~1.4 V的電位範圍內，在電極表面極少化學反應發生，為良好之工作電極。 H2 產生 PB buffer (pH 7.4), Scan rate: 100 mV/s

比較不同掃描速率的CV圖譜 掃描速率增加，其氧化還原電流亦增加 Working electrode: Au 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Scan rate (V/s) Working electrode: Au PB buffer (pH 7.4)

歡迎你們的參訪 1. 盧佩眉- 從電分析技術到生醫感測器之開發應用 2. 楊筱嵐- 電阻抗分析與其生醫奈米免疫檢測應用 解說者 主 題 1. 盧佩眉- 從電分析技術到生醫感測器之開發應用 2. 楊筱嵐- 電阻抗分析與其生醫奈米免疫檢測應用 3. 熊翌成- 原子力顯微鏡的液相中的細胞影像呈現 4. 楊梅玉- 拉曼(Raman)光譜法的原理和應用 5. 劉興倫- 二維與三維介電泳微流體晶片的微粒分離

電阻抗分析之應用 Detection of Saccharomyces cerevisiae immobilized on self-assembled monolayer (SAM) of alkanethiolate using electrochemical impedance spectroscopy Fig. 1. Schematic representations of yeast cells immobilization on the modified gold electrode with SAM. Hui Chena et al., Analytica Chimica Acta 554(2005)52–59

Biosensors & Bioelectronics 10 (1995) 789-795

The Comparison of Detection Method Detection limit (g/ml) Advantage/Disadvantage ELISA 10-5 – 10-9 Universal Sensitive Expensive Surface plasmon resonance (SPR) 10-8 – 10-9 Label-free Quartz crystal microbalance (QCM) 10-7 – 10-8 Electrochemical 10-10 – 10-11 Low cost and easy to be constructed Selective but useful only for electroactive analytes

電化學阻抗分析法於Protein A之檢測 電化學阻抗圖譜 電極表面修飾 N C O S Y H ▼ COOH (SAM) NH2 (IgG) (BSA) (Protein A) IM6 IM6 impedance analyzer 等效電路之建立 Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) 24

Introduction of EIS - Z(jw) = V(jw)/I(jw)= Zre(w) + jZim(w) Ox ne- Red Electrode Solution Double Layer Electric Cdl Zw Ret Rs Pt Ag/AgCl Ox + ne- ↔ Red 2.5 mM Fe(CN)64-及2.5 mM Fe(CN)63- Rs : Ohmic resistance of the electrolyte solution Zw : Warburg impedance Cdl : Double layer capacitance Ret : Electron-transfer resistance Low frequency High frequency Z(jw) = V(jw)/I(jw)= Zre(w) + jZim(w) Rs Rs+Ret 25

Staphylococcus aureus Infections 金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，大小約直徑1 mm，菌落顏色為金黃色，具有溶血能力，細胞壁上有Protein A可與免疫球蛋白(IgG)作結合，此特性常用來作診斷，嚴重會造成心內膜炎或敗血症。 http://www.ngensis.com/flora-ii/bacterium.htm

實驗步驟 使用IM-6電化學阻抗分析儀(以三極式的電極系統進行檢測並供給 5 mV的交流弦波訊號及100 mHz-100 kHz的掃描頻率)利用循環伏安法(-0.2~0.6 V, 100 mV/s ,半波電位為 0.217 V )量測金電極的背景值。 以無水酒精(99.95％)配製5 mM之11-Mercaptoundecanoic acid (11-MUA)，取2 ml 之硫醇溶液滴在金電極上修飾30 min。 隨後以無水酒精反覆沖洗電極，置入含有2.5 mM Fe(CN)63-/4-之(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid, MES) (20 mM; pH 4) 溶液中，進行阻抗分析與循環伏安法檢測。 以20 mM之MES (pH 4.6)為緩衝溶液，配置濃度為30 mM的EDC與2 mM的NHS，取2 ml 溶液滴在金電極上修飾30 min。 再將以PBS緩衝溶液配置好濃度為0.1 mg/ml 的抗體(IgG) ，取 2 ml 溶液滴在金電極上修飾1 hr。 將量測之阻抗曲線以Complex non-linear least-square (CNLS) 進行模擬電路之比對。

Experiment ， Au 11-MUA EDC/NHS N HO O SO3Na C H N H3C NH2 CH3 C O OH S

各修飾步驟的CV圖 (d) (c) (e)

各修飾步驟奈氏圖

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Principle of The Atomic Force Microscopy Semi - contact contact Expulsive force Semi - contact mode Distance between tip and sample Attractive force A. Simon and M.C. Durrieu, Micron, 37(2006)1–13 Contact mode Non - contact mode

System Structure of AFM Force sensing part：A cantilever with a tip Detection part：Laser and PSPD Feedback System PSPD Piezoelectric scanner Sample Topography Laser X Z Y Feedback system Cantilever Image

Principle of AFM (Laser在懸臂簧片反射示意圖) (Laser在懸臂簧片反射至PSPD示意圖) AFM微小探針通常是黏附在懸臂式的彈簧片上，當探針尖端與樣品表面接近時，因力場而產生作用力，造成懸臂簧片的微小偏折，此簧片的彈性變形量，可以利用簧片後方的STM探針所測得，也可以利用電容感應法(PSPD)、光學偵測法來感測。在掃描過程中，簧片的偏移訊號可以轉換成電流，輸入回饋迴路。

形貌和側向力的影像 X Y Z Mover 垂直信號的變化 即樣本的表面變化 Cantilever擺動的方向 X Y Z Mover 水平信號的變化 即樣本的材質變化

Measurement modes of AFM Amp:5~100 nm Amp:2~5 nm Distance:a few nm (1)接觸式(contact mode): 探針和樣品間距離約0.5奈米，探針和樣品間為排斥力(10-6-10-10牛頓) (2)非接觸式(non-contact mode): 探針和樣品間的距離約數十奈米，探針和樣品間為吸引力(凡得瓦爾力) (3)敲擊模式(tapping mode): 介於接觸式和非接觸式之間(探針高頻在z方向振動)

接觸式與非接觸式原子力顯微術的比較 接觸式原子力顯微術之整體評估： 敲擊式原子力顯微術之整體評估： 　吸附現象、 表面黏性、 彈性等因素會影響表面形貌 較容易刮傷樣品表面 表面形貌解析度較高 敲擊式原子力顯微術之整體評估： 　可減少樣品刮傷 空間解析度較差

The imaging principle of AFM 定力模式 定高度模式 - to detect the force change - to detect the change in the sample height 優點：適用表面起伏較大樣品 缺點：掃描速度較慢 優點：掃描速度較快 缺點：表面起伏不可太大 From：http://www.ntmdt.ru

實驗機台: NTMDT-BIO47 參數設定: Speed: 0.3 Hz Pix Number: 2562 points 樣本: SiHa Cells 探針: NANOSENSORSTM PL2-CONTR Diameter = 1.8 μm, Rod height > 2 μm, Spring constant = 0.096 N/m

細胞形貌影像圖 Normal cervical cell Wild-type cervical cancer cell Height image Height image 40

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Principle of Raman Spectroscopy Matter Absorption Transmitted Incident light Scattered light: Raman Elastic: (Rayleigh scattering) Inelastic: (Raman scattering)

以CCl4 為例 doubly degenerate triply degenerate fully symmetric 218 314 459 758 & 786

本實驗室之拉曼系統 Objective: 10X, 50X, 100X Substrate: Au/glass or other metals Laser: 532 nm, grating: 900 lines/mm, 至樣本後最大功率10 mW 633 nm, grating: 600 lines/mm, 至樣本後最大功率8 mW 780 nm, grating: 400 lines/mm, 至樣本後最大功率14 mW

血液 治療 Raman 一天、一星期或一個月 ~10 mins

A novel SERS actives Gold Nanoparticles@Mesoporous Silicas for Bacteria Fingerprint Discrimination silanol groups Au particle Silica S. aureus Side view Top view 1 mm 2500 1500 1000 500 100 Raman shift (cm-1) Intensity 2000 SERS Normal Raman 1. Organic-free  no Raman signal  SERS application 2. Silanol groups can have high affinity to bind with the proteins of the cells via hydrogen-bonding interaction.

1064 nm near-infrared multichannel Raman spectroscopy of fresh human lung tissues Young-Kun Min,1 Tatsuya Yamamoto,2 Ehiichi Kohda,3 Toshiaki Ito4 and Hiro-o Hamaguchi1∗ J. Raman Spectrosc. 2005; 36: 73–76

拉曼光譜的優點及應用 優點 應用 指紋性定性振動光譜 不用樣品製備 快速，無結構受損 高選擇度 所須樣品量少 拉曼光譜是直接量測分子結構的振動光譜，可對物質進行定性認證。物質結構的任何微小變化會非常敏感反映在拉曼光譜中，因而可用來研究物質的物理化學等各方面性質隨結構的變化。 高分子聚合物、奈米材料、電化學、半導體、薄膜、礦物學、生物、醫學藥品,等等……。

Fabrication of SERS on 3D DEP Chip Roughened shelter electrode Glass slide with roughened treatment JSR PR channel Electrode patterns on cover slip

On chip Surface Enhance Raman Scattering (SERS) Enhancement: ca. 50 folds! Bacteria: S. aureus red line: normal Raman 514 nm laser blue line: SERS Raman Raman intensity Exposure time: 10 sec, Accumulation: 3 times Raman shift (cm-1)

歡迎你們的參訪 1. 盧佩眉- 從電分析技術到生醫感測器之開發應用 2. 楊筱嵐- 電阻抗分析與其生醫奈米免疫檢測應用 解說者 主 題 1. 盧佩眉- 從電分析技術到生醫感測器之開發應用 2. 楊筱嵐- 電阻抗分析與其生醫奈米免疫檢測應用 3. 熊翌成- 原子力顯微鏡的液相中的細胞影像呈現 4. 楊梅玉- 拉曼(Raman)光譜法的原理和應用 5. 劉興倫- 二維與三維介電泳微流體晶片的微粒分離

介電泳生物晶片 Separation Capture

介電泳力(dielectrophoretic Force) pDEP nDEP frequency |εp *| > | εm*| |εp* | < | εm* | + + _ m A + _ m B Medium Re[fCM()]>0 : positive DEP Re[fCM()]<0: negative DEP - Plate electrode

2D微流體晶片結構 FDEP < FDrag 粒子會通過電極端 FDEP > FDrag 粒子會順著電極端前進 導引 分離 捕捉 COMSOL Simulation Software 20 mm Stronger area Weaker area FDEP < FDrag 粒子會通過電極端 FDEP > FDrag 粒子會順著電極端前進 導引 分離 捕捉 分離

3D微流體晶片結構 FDrag nFDEP 電極 FDEP < FDrag 粒子會通過電極端 粒子 導引 分離 捕捉 分離

材料與方法 1. 晶片規格 2. 樣本配製 3. 硬體設備 倒立式顯微鏡搭配影像攝影系統 微注射幫浦與訊號產生器 微流道高15 mm，長1 cm，寬1 mm 晶片大小 3 cm × 7.6 cm 2. 樣本配製 使用去離子水調配乳膠微粒(2 mm Dia.)濃度為6*107 /ml之溶液。 3. 硬體設備 倒立式顯微鏡搭配影像攝影系統 微注射幫浦與訊號產生器 http://www.olympus-global.com/en/global

實驗步驟 溶液的導電度測量:電導度計(CDM230) σPBS = 16000 µS/cm ρ : 電阻率 (Ω•cm)，ρ= 1/σ Latex配製:微粒的原液主要為水(70.0%)和latex(30.0%) 交流電振幅與頻率的調控: 藉由頻率的調控，可找出未知粒子的介電泳圖譜 ρ : 電阻率 (Ω•cm)，ρ= 1/σ K : cell constant (cm-1) 顆數: 濃度:

分離粒子過程 利用導引電極與分離電極所產生負介電泳力，分離大小不同的乳膠微粒，粒子直徑分別為2 mm與5 mm 。

粒子捕捉與量化 捕捉粒子的面積與流體的濃度關係 N = Vtrap / Vparticle= (Atrap× h) / (4/3 p r3) C = [N / (Flow rate × Ttrap)] × Dilution 俯視圖 側視圖

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