一、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力 测定（p125） 二、血清总胆固醇测定(p112) 三、尿酮体的定性检测(p120)

血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力测定（p125） 实验五十一 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力测定（p125）

体内两种重要的转氨酶 谷丙转氨酶（ ALT ；GPT）： 谷草转氨酶（ AST ；GOP）： 肝中活性最高 心肌中活性最高

临床意义 血清转氨酶活性，可作为临床疾病诊断和预后的指标之一。 * 07/16/96 临床意义 血清转氨酶活性，可作为临床疾病诊断和预后的指标之一。 在病毒性肝炎的潜伏期、急性发病期，以及隐性感染者均可有血清ALT升高；心肌梗死患者血清中AST明显升高。 转氨酶属细胞内酶，血清中的活性很低 ，患病时，细胞膜通透性增高或细胞破坏，转氨酶大量释放入血，造成血清中转氨酶活性明显升高。 * ##

[测定方法] 定时比色法（两点法） 酶联-紫外连续监测法

酶联-紫外连续监测法 原理： 丙酮酸+L-谷氨酸 L-丙氨酸+α-酮戊二酸 丙酮酸+NADH L-乳酸+NAD+ ALT 丙酮酸+L-谷氨酸 L-丙氨酸+α-酮戊二酸 LDH 丙酮酸+NADH L-乳酸+NAD+ 在340nm连续监测NADH的消耗量，从而计算出ALT的活力

定时比色法 国内采用的比色测定法有三种： 赖氏法（30min） 金氏法（60min） 改良穆氏法（30min） 1. 原理、试剂和操作步骤，作用时间略不同。 2. 主要不同点在其单位定义和标准曲线的绘制方法，因此，测定结果的单位数值也不相同。

国内较多采用赖氏法，其优点为： 标准曲线中两种酮酸的量客观反映酶作用的实际情况。 标准曲线上的单位数字也准确反映了酶活力大小。 3. 测定结果可以直接与分光光度法相比较。

改良赖氏法测定ALT活力 [原理]

与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活力。

为什么结果是可信的？ 吸收光谱有所不同，在520nm比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的光吸收远较丙酮酸二硝基苯腙为低。 在反应后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加，使干扰减少。 故520nm处吸光度增加之程度与反应体系中丙酮酸含量的增加基本成线性关系。 11

[操作] 1．标准曲线绘制 取大试管6支编号，按下表操作： 混匀，10分钟后以对照管调零，测定520nm波长的吸光度。 试 剂（ml） 对照 3 4 5 2mmol/L丙酮酸标准液 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 底物溶液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4) 0.1 混匀，37℃水浴5min；然后各管分别加入2,4-二硝基苯肼 2,4-二硝基苯肼 0.5 混匀，37℃水浴20min，然后各管分别加入0.4mol/L NaOH 0.4mol/L NaOH 5.0 相当于ALT活力单位 28 57 97 150 200 A520 混匀，10分钟后以对照管调零，测定520nm波长的吸光度。

混匀，10分钟后以对照管调零，测定520nm波长的吸光度。 2．酶活性测定 取中试管2支，编号，按下表操作： 试 剂 对 照 测 定 血清 — 0.1 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4) 底物溶液 0.5 混匀，37℃水浴30min，然后各管分别加入2,4-二硝基苯肼 2,4-二硝基苯肼 混匀，37℃水浴20min，然后各管分别加入0.4mol/L NaOH 0.4mol/L NaOH 5.0 A520 混匀，10分钟后以对照管调零，测定520nm波长的吸光度。

[参考正常值] ALT< 40U/L [要求] 反应时间要控制好 停止反应要迅速 血清吸取用移液器更准确 2人1份，两步反应一起完成

实验四十三 血清总胆固醇测定（p112） 15

胆固醇 结构： 具有环戊烷多氢菲结构 分布：广泛存在动物体内，脑及神经组织最为丰富。

功能 是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料；参与形成细胞膜。 临床意义：血清总胆固醇正常值2.59-6.47mmol/L；含量过高，胆固醇代谢可能发生障碍。AS患者的血清胆固醇含量往往偏高。因此测定血清总胆固醇含量将有助于诊断疾病。

方法：比色法（硫磷铁法、硫酸-醋酐法）; 胆固醇氧化酶法（试剂盒法） 原理： 游离胆固醇(FC) 血清总胆固醇(TC) 胆固醇酯(CE) 胆固醇酯酶 CE FC ＋ FFA 37℃水浴

原理： 红色醌亚胺＋4H2O 胆固醇氧化酶 FC Δ4-胆甾烯酮＋ H2O2 2H2O2＋4-氨基安替比林＋酚 37℃水浴 过氧化物酶

[操作步骤] 取试管3支，编号，按下表加样： 混匀后，置于37℃水浴中15min，在500nm波长下比色，以空白管调零，测定各管吸光度。 试 剂（ml） 标准管 测定管 空白管 血 清 － 0.02 5.18 mmol/L胆固醇标准液 酶工作液 1.5 A500 混匀后，置于37℃水浴中15min，在500nm波长下比色，以空白管调零，测定各管吸光度。

[计算] A测定 × 5.18mmol/L TC(mmol/L)= A标准 血清TC参考值：2.59～6.47mmol/L

[要求] 1. 小试管在操作前尽量保持干燥 2. 用移液器量取血清及胆固醇标准液 3.样品用量少，用小的比色杯比色 4. 测定波长为500nm 5. 2人1组

实验四十八 尿酮体定性检测（p120）

[临床意义] 尿酮体阳性主要见于糖尿病酮症酸中毒、急性风湿热、结核病、败血症、急性胃肠炎伴严重脱水、麻醉后、中毒性休克等。

[原理] 乙酰乙酸 OH- 紫红色化合物 酮体 丙酮 Na2[Fe(CN)5NO] β-羟丁酸

[操作] 取“酮体测试粉末”少许置滤纸上，直径 约0.5cm的圆形。 2. 取待测尿液1滴，滴于测试粉末上。 2. 取待测尿液1滴，滴于测试粉末上。 3. 稍待1~2min，观察结果。 4. 结果判断指标 不出现紫红色：(－)尿中酮体<100mg/L 出现紫红色：阳性，尿中酮体>100mg/L 可根据紫红色的深浅分别以(+)、(+ +)、 (+ + +)、(+ + + +)表示。

[参考正常值] 酮体< 100mg/天，且主要是丙酮 [要求] 粉末不能涂布太厚 结果及时做好记录 1人1份