第八章 荧光免疫技术

第一节 概述

荧光的基本知识 荧光（fluorescence） 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。

荧光的基本知识 发射光谱和激发光谱 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。

荧光的基本知识 荧光效率 定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率 计算公式: 荧光效率=

荧光的基本知识 荧光寿命 定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。 各种荧光物质的荧光寿命不同。

荧光的基本知识 荧光淬灭 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。

荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 常用的荧光物质 荧光物质 最大吸收光谱 最大发射光谱 应用 异硫氰酸荧光素 (FITC) 490～495nm 520～530nm （黄绿色） FAT、荧光偏振免疫测定 四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标记FAT 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 550nm 620nm（橙红色） 藻红蛋白（PE） 490-560nm 595nm（红色） 双标记FAT、流式细胞术 7-氨基-4-甲基香豆素 354nm 430nm（蓝色） 双标记或多标记FAT Eu3+螯合物 340nm 613nm 时间分辨荧光免疫测定

第二节 荧光抗体技术

荧光抗体技术的基本原理 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后 荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位， 对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行 定性和滴度测定。

荧光抗体技术的内容 标本制作 荧光抗体制备 荧光抗体染色 荧光显微镜检查

标本的制作 标本的类型 组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞

标本的制作 组织切片的类型 冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。

标本的制作 标本的固定和保存 固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保 存：4℃、-20℃

荧光抗体的制备 抗体要求 高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG

荧光抗体的制备 荧光素要求 有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 标记方法简单、安全无毒。 与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

荧光抗体的制备 抗体的荧光素标记 标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 标记方法: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低

荧光抗体的制备 荧光抗体的纯化 去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收

荧光抗体的制备 荧光抗体的鉴定 荧光素与蛋白结合率： F/P= 抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释

荧光抗体的制备 荧光抗体的保存 -20℃：保存1～2年 真空干燥：长期保存

荧光抗体染色 直接法 荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。 直接荧光抗体染色法示意图

荧光抗体染色 间接法 特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。 间接荧光抗体染色法示意图

荧光抗体染色 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。

荧光显微镜检查 荧光显微镜 利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

荧光显微镜检查 荧光显微镜 光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头：消色差镜头

荧光显微镜检查 荧光显微镜 滤光片 隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。

荧光显微镜检查 荧光显微镜 光路 透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。 透射荧光显微镜光路(a) 落射荧光显微镜光路(b)

荧光显微镜检查 荧光抗体染色结果判断 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型

荧光显微镜检查 荧光抗体染色结果判断 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “++”：荧光明亮。 “+++”：耀眼强荧光。 “-”：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “++”：荧光明亮。 “+++”：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

第三节 荧光免疫分析的类型

荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪 检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量 或超微量物质进行定量测定。

荧光免疫技术的类型 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光抗体技术 均相荧光免疫测定 （homogeneous fluorescence immunoassay） 荧光免疫技术 荧光免疫测定 非均相荧光免疫测定 （heterogeneous fluorescence immunoassay）

荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定

时间分辨荧光免疫测定 基本原理 时间分辨 时间分辨检测原理示意图 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 时间分辨检测原理示意图

时间分辨荧光免疫测定 基本原理 stokes位移 stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠

时间分辨荧光免疫测定 基本原理 发射光谱和激发光谱 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少

时间分辨荧光免疫测定 基本原理 荧光标记物的相对比活性 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高

时间分辨荧光免疫测定 基本原理 信号增强 Eu3+标记抗原抗体复合物 酸性增强液 结合β-二酮体 Eu3+解离 荧光增强

时间分辨荧光免疫测定 标记物 镧系元素 常见荧光物质的荧光寿命 铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+) 钕(Nd3+) 荧光寿命(ns) 非特异荧光背景 1～10 Sm3+ -β-NTA 65000 人血清蛋白 4.1 Sm3+-PTA 60000 球蛋白 3.0 Eu3+-β-NTA 714000 细胞色素C 3.5 Eu3+-PTA 925000 FITC 4.5 Tb3+-PTA 96000 丹黄酰氯 14 Dy3+-PTA 1000 罗丹明B 镧系元素 铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+) 钕(Nd3+) 镝(Dy3+)

时间分辨荧光免疫测定 标记方法 双功能螯合剂： 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 标记方法： 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA） 标记方法： 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+

时间分辨荧光免疫测定 方法类型 双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法

时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图 方法类型 双抗体夹心法 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检 抗原结合，形成固相抗体-待检 抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性 增强液下，Eu3+解离，340nm激发 光下发射613nm荧光。 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图

时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗体竞争法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合, 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧 光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。

时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体， 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强 度，荧光强度与待检抗原含量成反比。

时间分辨荧光免疫测定 方法评价 灵敏度高：最小检出量10-18mol/L 分析范围宽：4～5个数量级 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高

荧光偏振免疫测定 基本原理 光线通过偏振滤光片后， 形成一个方向的平面光称 为偏振光。 偏振光(蓝光,485nm) 荧光物质 偏振荧光(绿光,525nm～550nm)

荧光偏振免疫测定 基本原理 荧光偏振免疫测定原理示意图 AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 抗原抗体竞争反应 AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱 待检抗原含量与偏振荧光强度成反比 基本原理 荧光偏振免疫测定原理示意图

荧光偏振免疫测定 方法评价 样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好 快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低

荧光酶免疫测定 基本原理 荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 碱性磷酸酶标记抗体或抗原， 固相载体包被抗原或抗体， 酶分解4-MUP，脱磷酸根基团 形成4-MU，360nm激发光照 射，发出450nm荧光。 荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图

荧光酶免疫测定 酶和荧光底物 荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物 标记酶 底物 荧光产物 激发光(nm) 荧光(nm) 相应信号 碱性磷酸酶 4-MUP 4-MU 360 450 10 β-半乳糖苷酶 4-MUG 辣根过氧化物酶 HPA 二聚体 317 414 0.03

荧光酶免疫测定 方法类型 双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法

荧光酶免疫测定 方法类型 双抗体夹心法 固相抗体和酶标记抗体与 待检原反应，形成固相抗 体-抗原-酶标抗体复合物， 加入底物进行酶促发光反 应，发光量与待检抗原 含量成正比。 荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图

荧光酶免疫测定 方法类型 双抗原夹心法 固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相 抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物进行 酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。

荧光酶免疫测定 方法类型 固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体， 洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形 成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光 反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。

荧光酶免疫测定 方法评价 用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，提高灵敏度 背景荧光干扰测定，用固相荧光酶免疫测定效果好

第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用

荧光抗体技术的应用 ①自身抗体检测 抗核抗体(核膜型) 抗核抗体(均质型) 抗核抗体(斑点型)

荧光抗体技术的应用 ②病原体检测 细菌（藤黄微球菌 ) 寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）

荧光抗体技术的应用 ③免疫病理检测 肿瘤（人肝癌细胞）

荧光免疫测定的应用 时间分辨荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定： 荧光酶免疫测定： 蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等 药物、维生素、激素、常规生化项目等 荧光酶免疫测定： 病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等